13个甘蓝型油菜GPATs编码基因的酵母遗传互补功能鉴定

发布时间：2024-04-21 23:08

　　3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferases, GPAT)是催化植物甘油脂从头合成第1步酰化反应的限速酶。分离和鉴定甘蓝型油菜(Brasscia napus)的GPAT编码基因将有助于深入解析种子中甘油脂的合成代谢机制。本研究通过反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)扩增获得13个甘蓝型油菜中具有酰基转移酶保守结构域的候选编码基因,构建至酵母(Saccharomyces cerevisiae)异源表达载体y ADH1-p YES2-Kan V2 (外源基因表达受葡萄糖诱导,受半乳糖抑制)。重组酵母表达载体酶切和测序验证结果显示,克隆的13个基因片段大小和序列与预期相符;通过氨基酸序列比对分析,发现克隆基因编码的氨基酸序列分别含有1～2个跨膜结构域和4个酰基转移酶保守序列。进一步利用本实验室创建的高效条件致死型酵母双敲除突变体菌株ZAFU1筛选体系(BY4742, gat1Δgat2Δ+[pGAL1::At GPAT1 LEU2])进行遗传互补验证,结果显示,在葡萄糖诱导条件下,BnGPA...

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【部分图文】：

图1酵母表达载体pYES2-yADH1-KanV2简要结构

酵母(S.cerevisiae)菌株ZAFU1(BY4742,gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1LEU2])感受态细胞制备参照本实验室Lei等(2018)的方法。重组酵母表达质粒转化3μg，转化液分别涂布于SC-Ura-His-Leu+Glucose和S....

图2BnGPAT家族成员的氨基酸序列比对

进一步从半乳糖培养基中挑取各外源基因转化的单克隆进行培养，经浓度梯度稀释实验进一步确认BnGPAT1-1和BnGPAT9-1具有类似酵母酰基转移酶编码基因YKR067w(GAT1)的功能(Zhengetal.,2001)。结果显示，BnGPAT4-1和BnGPAT4-2基因....

图3BnGPATs重组酵母表达载体双酶切鉴定

图2BnGPAT家族成员的氨基酸序列比对图4部分异源表达BnGPATs基因在条件型致死酵母双突变体菌株ZAFU1中的功能遗传互补

图4部分异源表达BnGPATs基因在条件型致死酵母双突变体菌株ZAFU1中的功能遗传互补

图3BnGPATs重组酵母表达载体双酶切鉴定2.4酵母外源目的基因验证

本文编号：3961582