人巨细胞病毒RNA1.2基因区天然反义转录本结构的研究及其功能初探

发布时间：2024-04-23 02:27

　　目的:人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)潜伏感染在人群中占50%以上,在健康的成年人中通常表现为潜伏感染,但在免疫功能缺陷的患者和新生儿中会引起致命的感染。HCMV感染胎儿导致先天性巨细胞病毒(Congenital cytomegalovirus,cCMV)感染,是危害婴儿围生期健康的重要因素。cCMV感染的致病机制一直以来都是病毒学领域的研究热点之一。HCMV是基因组最大的人感染病毒之一,预测能编码165个开放阅读框架(open reading frame,ORF),长而复杂的基因组决定了其复杂的编码能力,存在正义转录、反义转录、可变剪切、非编码转录等多种方式。HCMV的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)从基因组转录而来,在RNA水平行使各种生物学功能。目前,HCMV的ncRNA转录本特征和功能尚未研究清楚,明确转录本结构、转录时相与转录方式,对于揭示HCMV ncRNA功能及致病机制具有十分重要的意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类不具有编码蛋白质能力,长度大于200个核苷酸的R...

【文章页数】：79 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 :人巨细胞病毒RNA1.2基因区新发现一簇天然反义转录本及其结构的研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料
            2.1.1 病毒标本
            2.1.2 细胞系
            2.1.3 主要试剂
            2.1.4 主要仪器
        2.2 方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 HCMV Han株与v HAN-BAC株的接种与传代培养
            2.2.3 蚀斑法测定HCMV Han株滴度
            2.2.4 v HAN-BAC株病毒颗粒纯化
            2.2.5 v HAN-BAC病毒颗粒滴度测定
            2.2.6 HCMV感染HELF不同时期总RNA的制备和收集[30]
            2.2.7 总RNA提取
            2.2.8 总RNA样本去除DNA
            2.2.9 病毒基因组DNA提取
            2.2.10 病毒感染HELF细胞的总RNA链特异性高通量测序
            2.2.11 引物设计
            2.2.12 Northern boltting
            2.2.13 RACE(Rapid amplification of c DNA ends)
            2.2.14 BLAST和序列分析
    3 实验结果
        3.1 HCMV临床分离株RNA-seq结果
        3.2 HCMV感染对人类宿主细胞基因转录的影响
        3.3 RNA1.2基因区域的反义转录现象
        3.4 RNA1.2 AST的 Northern bolt鉴定
        3.5 RNA1.2 ASTs的 RACE结果
        3.6 RNA1.2 ASTs序列特征分析
    4 讨论
    5 结论
第二部分 :人巨细胞病毒RNA1.2 ASTs功能初探
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料
            2.1.1 病毒标本、细胞系
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器
        2.2 方法
            2.2.1 细胞培养、病毒毒株制备、病毒颗粒纯化
            2.2.2 反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASO)干扰下调RNA1.2 ASTs
            2.2.3 总RNA提取、Northern blotting
            2.2.4 RNA pull down
            2.2.5 蛋白质谱分析
            2.2.6 提取细胞总蛋白
            2.2.7 蛋白浓度定量(BCA法)
            2.2.8 蛋白免疫印迹(Western blotting)
            2.2.9 蛋白免疫印迹相关液体的配制
            2.2.10 差异基因的富集分析
    3 结果
        3.1 下调RNA1.2ASTs的表达对RNA1.2 表达水平的影响
        3.2 RNA1.2 ASTs结合蛋白捕获及鉴定
        3.3 RNA1.2 ASTs结合蛋白生物功能富集分析
        3.4 RNA1.2ASTs结合蛋白的Western blot验证
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3962478