斜纹夜蛾性别决定关键基因研究及遗传调控品系的构建

发布时间：2024-10-05 05:25

　　斜纹夜蛾（Spodoptera litura）是重要的农业害虫,危害99科100多种植物,每年给我国农业生产造成严重损失,因此研发高效的斜纹夜蛾防治方法一直是科研工作者孜孜以求的目标。传统化学防治方法会引起斜纹夜蛾产生严重抗性,且农药残留问题也一直是危害人类健康的潜在因素,所以迫切需要开发无公害防治斜纹夜蛾的方法。近年来,随着基因组数据积累及基因编辑技术的发展,非模式昆虫的基因功能解析以及靶标基因的筛选成为可能,为更好地开发害虫生物防治方法提供了强有力的技术支撑。本研究旨在利用基因编辑技术研究斜纹夜蛾性别决定通路关键基因,进而开发出能够防治斜纹夜蛾的有效方案。为达成这一目标进行了如下研究:第一,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建斜纹夜蛾基因组编辑平台,为研究斜纹夜蛾基因功能奠定基础;第二,寻找斜纹夜蛾性别决定通路和生殖调控方面关键基因,利用斜纹夜蛾基因组编辑平台研究靶标基因功能;第三,构建斜纹夜蛾害虫防治遗传调控品系。相关研究成果可为斜纹夜蛾害虫防治提供理论基础和解决方案,具体研究内容和结果如下:1.基于CRISPR/Cas9技术的斜纹夜蛾基因组编辑平台的构建CRISPR/Ca...

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
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第一章 绪论
    1.1 鳞翅目害虫概述
    1.2 斜纹夜蛾概述
        1.2.1 斜纹夜蛾危害特点
        1.2.2 斜纹夜蛾发生危害规律
        1.2.3 斜纹夜蛾防控措施
    1.3 昆虫种群遗传调控技术的研究进展
        1.3.1 辐射不育技术研究进展
        1.3.2 遗传调控技术研究进展
    1.4 昆虫基因组编辑技术研究进展
        1.4.1 ZFNs技术研究进展
        1.4.2 TALENs技术研究进展
        1.4.3 CRISPR/Cas9 技术研究进展
        1.4.4 基因组编辑系统在害虫种群控制方面的研究现状
    1.5 研究目的和意义
        1.5.1 斜纹夜蛾基是一种世界性分布重要的农业害虫
        1.5.2 斜纹夜蛾需要新的无公害防治方法
        1.5.3 构建斜纹夜蛾遗传调控品系是害虫防治的方向
    1.6 主要研究内容
        1.6.1 斜纹夜蛾基因组编辑平台的构建
        1.6.2 斜纹夜蛾害虫防治靶标基因的筛选
        1.6.3 利用基因组编辑平台构建斜纹夜蛾防治品系
    1.7 技术路线
第二章 基于基因组编辑技术的斜纹夜蛾遗传操作平台构建
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 RNA提取
        2.2.3 cDNA的合成
        2.2.4 Ebony基因ORF序列的扩增
        2.2.5 系统进化树的构建
        2.2.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术方法
        2.2.7 表型观察及基因组DNA突变检测
        2.2.8 Real-Time PCR(RT-PCR)检测
        2.2.9 斜纹夜蛾人工饲料的配制
    2.3 实验结果
        2.3.1 斜纹夜蛾Ebony基因的序列和进化树分析
        2.3.2 斜纹夜蛾Ebony基因时空表达谱分析
        2.3.3 斜纹夜蛾Ebony基因突变导致蛹壳颜色加深
        2.3.4 Ebony基因突变导致斜纹夜蛾成虫颜色加深
        2.3.5 注射Cas9和sgRNA诱导的基因型
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 斜纹夜蛾性别决定关键基因Masc和 Doublesex功能研究.
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 RNA的提取
        3.2.3 cDNA的合成
        3.2.4 扩增Masc和 Doublesex基因的ORF序列
        3.2.5 系统进化树的构建
        3.2.6 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术方法
        3.2.7 表型观察及基因组DNA突变检测
        3.2.8 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)检测
        3.2.9 数据分析
        3.2.10 Masc过表达质粒构建
        3.2.11 质粒大量提取与纯化
        3.2.12 细胞转染方法
        3.2.13 精子染色
    3.3 实验结果
        3.3.1 SlMasc基因在BmN雌性卵巢细胞系的转染
        3.3.2 过表达SlMasc基因导致雄性Doublesex剪接体出现
        3.3.3 CRISPR/Cas9 介导的SlMasc基因的突变检测
        3.3.4 SlMasc基因突变导致雄性个体外生殖器畸形
        3.3.5 SlMasc基因突变导致雌性比例异常
        3.3.6 SlDoublesex基因进化保守性分析
        3.3.7 CRISPR/Cas9 介导的SlDoublesex基因突变
        3.3.8 SlDoublesex基因突变导致雌雄内外生殖器异常
        3.3.9 qPCR鉴定相关基因的表达
        3.3.10 SlDoublesex基因突变导致雌雄不育
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 基于基因组编辑技术的斜纹夜蛾不育品系的构建研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 RNA的提取
        4.2.3 cDNA的合成
        4.2.4 扩增Ser2和Osp基因的ORF序列
        4.2.5 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术方法
        4.2.6 表型观察及基因组DNA突变检测
        4.2.7 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)检测
        4.2.8 数据分析
    4.3 实验结果
        4.3.1 斜纹夜蛾Ser2 基因时空表达谱分析
        4.3.2 CRISPR/Cas9 介导的斜纹夜蛾Ser2 基因突变
        4.3.3 斜纹夜蛾Ser2 基因突变导致成虫雄性不育
        4.3.4 Ser2 雄性不育可遗传性检测
        4.3.5 qPCR检测Ser2 突变下游基因变化
        4.3.6 斜纹夜蛾Osp基因时空表达谱分析
        4.3.7 CRISPR/Cas9 介导的斜纹夜蛾Osp基因突变
        4.3.8 斜纹夜蛾Osp基因突变导致成虫雌性不育
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 总结与展望
    5.1 研究总结
    5.2 主要创新点
    5.3 不足与展望
参考文献
附录一 实验主要药品试剂
附录二 实验主要仪器
附录三 攻读博士学位期间发表的学术论文及参与的项目
致谢



本文编号：4007584