梅花丁子香酚合酶基因的克隆及功能分析

发布时间：2017-05-28 11:03

  本文关键词：梅花丁子香酚合酶基因的克隆及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：花香是植物重要的观赏性状,在吸引昆虫授粉、保障植物结实和防御病虫侵害等方面具有重要的作用,同时有利于提高植物本身的经济价值。梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)是我国的传统名花,具有典型的香气。丁子香酚是梅花重要的特征香气成分之一,属于苯丙烷类化合物,其生物合成是以乙酸松柏酯为底物、通过丁子香酚合酶的催化作用完成的。目前,关于梅花花香的研究仍处于起步阶段,尚未深入到合成代谢的分子机制水平。本论文以真梅系梅花品种‘三轮玉蝶’为试验材料,首次在梅花中克隆得到丁子香酚合酶基因,通过对其进行生物信息学分析、表达模式探究及转基因初步验证,得出以下结论：1.以‘三轮玉蝶’的盛花期花朵为试验材料,通过RT-PCR技术克隆得到3个丁子香酚合酶基因,分别命名为PmEGS1/PmEGS2/PmEGS3,包含的开放阅读框为927bp/951 bp/930bp,编码308/316/309个氨基酸,分子量约为33.9 kDa/35.3 kDa/ 33.8 kDa,位于梅花的第2/3/6条染色体上,基因序列号分别为Pm005841/Pm012360/ Pm021776。DNAMAN和系统进化树分析显示,3个基因的cDNA全长及其推导的氨基酸序列均与草莓、月季、罗勒、仙女扇、矮牵牛、万代兰等物种中的EGS基因具有很高的一致性和同源性,在EGS基因所特有的结构域KQVDVVIS和KIIAAIK上高度保守。2.以‘三轮玉蝶’的4个开花时期(蕾期、初花期、盛花期、末花期)和盛花期花朵3个不同部位(花瓣、雄蕊、花萼+雌蕊)为试验材料,进行荧光定量PCR反应。相对定量结果显示,PmEGS2和PmEGS3主要分布在花瓣和雄蕊中,相对表达量随开花进程一直增加,至末花期达到最大值,与丁子香酚顶空挥发及内源含量的变化规律一致,推测二者均为丁子香酚代谢途径中生成丁子香酚的关键基因；且PmEGS2的变化幅度更大,表明具有更高的结合效率。PmEGS1表达趋势相反,可能被其他竞争代谢途径所抑制。3.将表达最显著的PmEGS2与植物表达载体pCAMBIA1304相连接,通过农杆菌介导法转入矮牵牛(Petunia hybrida 'W115')。利用GC/MS检测对照植株和转基因植株的花香成分,发现对照植株中不含丁子香酚,而转基因植株中含有少量的丁子香酚和微量的甲基丁子香酚,初步证明PmEGS2基因在丁子香酚通路发挥了作用,参与了丁子香酚的生物合成和代谢过程。本论文从具有典型香气的梅花品种‘三轮玉蝶’中克隆得到3个丁子香酚合酶基因,对其表达情况进行了初步分析,并将表达最显著的PmEGS2转入花香模式植物矮牵牛中,对基因功能进行综合研究,以期初步厘清其功能和分子机制,为李属植物香花育种提供理论依据。
【关键词】：梅花 丁子香酚合酶 基因克隆 表达分析 转基因
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S685.17
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1 引言10-22
• 1.1 植物花香化合物的种类10-11
• 1.2 苯丙烷/苯环型化合物的代谢途径11-13
• 1.3 植物花香代谢调控与基因工程13-16
• 1.3.1 植物花香化合物的代谢调控13-14
• 1.3.2 植物花香基因的分离14-15
• 1.3.3 植物花香基因工程的育种策略及问题15-16
• 1.3.4 植物花香基因工程展望16
• 1.4 植物丁子香酚合酶研究进展16-18
• 1.4.1 丁子香酚16-17
• 1.4.2 丁子香酚合酶基因17-18
• 1.5 梅花花香研究进展18-19
• 1.6 本研究的设计思想19-22
• 1.6.1 研究的目的和意义19
• 1.6.2 研究内容19
• 1.6.3 技术路线19-22
• 2 PmEGSs基因的克隆与序列分析22-38
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 主要试剂与耗材22
• 2.1.3 主要仪器与设备22
• 2.1.4 试验引物22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 总RNA的提取与检测23-24
• 2.2.2 cDNA第一链的合成24-25
• 2.2.3 RT-PCR扩增及产物检测25
• 2.2.4 PCR产物的纯化、连接、转化与鉴定25-27
• 2.2.5 PmEGSs基因生物信息学分析27
• 2.3 结果与分析27-35
• 2.3.1 PmEGSs基因的克隆27-28
• 2.3.2 PmEGSs基因编码蛋白的结构分析28-34
• 2.3.3 PmEGSs基因编码蛋白的多重序列比对及进化树分析34-35
• 2.4 结论与讨论35-38
• 3 PmEGSs基因的表达模式探究38-46
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 植物材料38
• 3.1.2 主要试剂与耗材38
• 3.1.3 主要仪器与设备38
• 3.1.4 试验引物38-39
• 3.2 方法39-40
• 3.2.1 RNA的提取及cDNA第一链的合成39-40
• 3.2.2 实时荧光定量PCR40
• 3.3 结果与分析40-42
• 3.3.1 PmEGSs基因在不同开花时期的表达分析40-41
• 3.3.2 PmEGSs基因在盛花期花朵不同部位的表达分析41-42
• 3.4 结论与讨论42-46
• 4 转基因功能验证46-58
• 4.1 材料46
• 4.1.1 植物材料46
• 4.1.2 菌株与载体46
• 4.1.3 主要试剂与耗材46
• 4.1.4 主要仪器与设备46
• 4.2 方法46-51
• 4.2.1 载体的构建及检测46-48
• 4.2.2 农杆菌介导法转化矮牵牛48-50
• 4.2.3 转基因矮牵牛的检测50-51
• 4.3 结果与分析51-54
• 4.3.1 植物表达载体pCAMBIA1304-PmEGS2的构建及农杆菌的转化51-52
• 4.3.2 转基因矮牵牛的筛选与检测52-54
• 4.4 结论与讨论54-58
• 5 结论58-60
• 5.1 结论58-59
• 5.2 展望59-60
• 参考文献60-64
• 个人简介64-66
• 导师简介66-68
• 致谢68

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