基于紫外诱变与生物合成基因簇倍增的多氧霉素高产菌株构建

发布时间：2025-01-15 16:57

　　 多氧霉素是一种抑制几丁质生物合成的广谱抗真菌类抗生素,对多种真菌引起的农作物病害具有显著的防治效果,且对人和动植物无害,是一种绿色安全的生物农药,目前仍然是全球应用最广泛的抗真菌农药之一。多氧霉素的主要作用机制在于竞争性抑制真菌细胞壁合成中几丁质合成酶的活性,因此对农作物真菌病害具有显著的防治效果。现代农业的发展对于绿色生物农药的需求日益增长,本研究的目的是构建多氧霉素关键活性成分——多氧霉素B的高产菌株。从一株自土壤环境中分离得到的金色链霉菌（Streptomyces ansochromogenes）出发,首先通过紫外诱变初步筛选多氧霉素B的高产突变菌株;然后利用ExoCET直接克隆技术对多氧霉素基因簇pol进行克隆,并在基因簇第1个基因上游分别添加原始启动子和kas Op*强启动子,通过整合酶phi C31将基因簇整合到突变株染色体上构建pol倍增菌株,HPLC-MS检测比较多氧霉素B的产量。通过紫外诱变育种和筛选获得了链霉菌突变株Pol-12菌株,其产量较野生型菌株提高了1.2倍。为进一步提高多氧霉素产量,利用ExoCET直接克隆技术将pol克隆至p15A载体,并通过接合转移转化...

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【部分图文】：

图2 链霉菌S.ansochromogenes Pol-12的基因组及其限制性内切酶Bsr DⅠ酶切产物M—Takara DL10 000 DNA Marker;1—S.ansochromogenes Pol-12的基因组DNA;2—S.ansochromogenes Pol-12基因组DNA的Bsr DⅠ酶切产物

来源于噬菌体的Red/ET重组酶可以在大肠杆菌中介导一个线性DNA分子和一个环状DNA分子发生重组，简称线环重组（linear-circularhomolo‐gousrecombination,LCHR）。为了方便下一步接合转移和位点特异性元件的插入，将含有筛选标记阿泊拉霉素....

图1 多氧霉素的结构与组成[6]

多氧霉素的化学结构与几丁质合成酶（chitinsynthase）的底物尿苷二磷酸酯-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）相似，因而能够竞争性抑制真菌细胞壁中几丁质的合成，导致细胞因渗透压差异而裂解[3-4]。Isono等[3,5-7]将可可链霉菌阿苏变种的发酵液进行多步....

图3 直接克隆载体的PCR扩增产物

图2链霉菌S.ansochromogenesPol-12的基因组及其限制性内切酶BsrDⅠ酶切产物M—TakaraDL10000DNAMarker;1—S.ansochromogenesPol-12的基因组DNA;2—S.ansochromogenesPol-1....

图4 多氧霉素基因簇的直接克隆

图3直接克隆载体的PCR扩增产物2.3.2原始启动子、kasOp*启动子以及接合转移和位点特异性整合元件的插入

本文编号：4027589