MMR系统缺陷的食源性沙门氏菌超级突变子相关功能基因的突变与表达及其差异蛋白质研究

发布时间：2017-05-29 00:01

  本文关键词：MMR系统缺陷的食源性沙门氏菌超级突变子相关功能基因的突变与表达及其差异蛋白质研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：沙门氏菌中存在错配修复(Mismatch repair,MMR)系统突变/缺陷不仅会导致其在DNA复制过程中丧失修复功能,从而造成因基因突变而产生的耐药性,同时也会促使基因水平转移(Horizontal gene transfer,HGT)的频率升高,导致因外源抗性基因的插入重组而使沙门氏菌耐药性增加。本研究主要以4株错配修复系统缺陷的食源性沙门氏菌超级突变子为材料,探索其中20个功能基因的突变和表达对超级突变子耐药性和突变频率的影响,寻找突变株中相关差异表达蛋白质(组)的种类及其与耐药性和突变频率的关系。结果表明,与沙门氏菌模式菌株Salmonella typhimurium LT2相比,在4株超级突变子的20个与耐药和突变频率相关功能基因中,共有8个基因(TolC、ParC、Mut S、MutL、MutT、UvrD、OmpF和HilA)发生了不同程度的氨基酸突变,而在AcrA,AcrB,ArcE,MarA,MarR,DnaQ,GyrA,ParE,MutH,OmpR和SoxS中均没有检测到氨基酸变异。分析各菌株上述基因在mRNA水平的相对表达量时发现,4株超级突变子中的mutS,marR和parC基因相对表达量均增加,而基因acrB和mutH的表达量则均下降。值得关注的是,4株超级突变子的突变频率都显示增加,而MMR系统中的关键识别修复基因mutS,mutL和uvr D的表达量却下降。通过双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)图谱分析,共在超级突变子中检测到137个显著差异表达蛋白点,110个只在超级突变子中表达的特异新增蛋白点和86个只在标准菌株Salmonella typhimurium LT2中表达的特异蛋白点。选取以上蛋白点中的68个差异蛋白点(包括:38个显著上调差异表达蛋白点、11个显著下调差异蛋白点和19个新增特异蛋白点)进行质谱(Mass spectrometry,MS)鉴定。结果表明,在4株超级突变子中显著差异表达上调的蛋白产物有30S核糖体蛋白家族(包括S1、S2和S6)、甘油激酶、SSU核糖体蛋白S2p、分子伴侣Dnak、短链脱氢酶、膜间质蛋白和磷酸甘油酸激酶。蛋白产物,如:延长因子Ts、β亚基F0F1 ATP合成酶、50S核糖体蛋白L7/L12、赖氨酸-tRNA合成酶、ɑ螺旋卷曲蛋白和鞭毛蛋白在一些菌株中的表达量则表现为下调。同样也存在许只在沙门氏菌超级突变子中表达而不在标准菌株中表达的特异性蛋白产物有只在菌株31中表达的延长因子Tu、转录调节因子、外膜蛋白X、外膜蛋白A、甘油激酶和蛋白酶PmbA;只在菌株1171R中表达的外膜蛋白A、鞭毛蛋白、膜间质蛋白和磷酸甘油酸变位酶;只在菌株S8XC001a中表达的鞭毛合成蛋白、异柠檬酸脱氢酶和蛋白质yci F;只在菌株103D中表达的转录终止因子Rho和冷休克蛋白。本研究较全面的解释了错配修复系统缺陷的沙门氏菌中功能基因的突变与表达及其蛋白质表达对突变频率的增加和多重耐药性(Multi-drug resistance,MDR)的影响,同时对食品安全控制提供了信息基础。
【关键词】：沙门氏菌超级突变子 错配修复系统 双向电泳 质谱分析 蛋白质组学
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 英文缩略词表10-14
• 第一章 文献综述14-22
• 1.1 沙门氏菌概述14-17
• 1.1.1 沙门氏菌14
• 1.1.2 沙门氏菌多重耐药性14-15
• 1.1.3 沙门氏菌超级突变子与耐药性15
• 1.1.4 甲基导向错配修复系统（Methyl-directed Mismatch repair, MMR）15-17
• 1.2 细菌蛋白质组学17-18
• 1.2.1 蛋白质组学17
• 1.2.2 双向电泳技术和质谱技术17-18
• 1.3 国内外研究现状18-19
• 1.4 研究的目的与意义19-20
• 1.5 研究内容和技术路线20-22
• 1.5.1 研究内容20-21
• 1.5.2 技术路线21-22
• 第二章 沙门氏菌超级突变子中20个功能基因的碱基突变和表达水平的研究22-30
• 2.1 实验材料22-23
• 2.1.1 实验菌株22
• 2.1.2 仪器与试剂22-23
• 2.2 实验方法23-26
• 2.2.1 PCR扩增和基因测序23-24
• 2.2.2 采用实时定量PCR方法检测功能基因在m RNA水平的表达情况24-26
• 2.3 结果与分析26-30
• 2.3.1 测序结果26
• 2.3.2 细菌总RNA的提取26-27
• 2.3.3 功能基因在mRNA相对表达水平27-30
• 第三章 沙门氏菌超级突变子中全菌蛋白质组学研究及差异蛋白的质谱分析30-39
• 3.1 材料与设备30
• 3.1.1 实验材料与试剂30
• 3.1.2 实验设备30
• 3.2 实验方法30-32
• 3.2.1 双向电泳30-32
• 3.2.2 蛋白差异点质谱鉴定32
• 3.3 结果与分析32-39
• 3.3.1 双向电泳结果32-36
• 3.3.2 质谱分析结果36-39
• 第四章 结果讨论与创新点39-41
• 4.1 结果讨论39-40
• 4.2 创新点40-41
• 参考文献41-45
• 致谢45-46
• 作者简介46

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