人参发根体细胞胚胎发生初期相关基因的表达分析

发布时间：2017-06-06 23:10

  本文关键词：人参发根体细胞胚胎发生初期相关基因的表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人参为五加科多年生草本植物,是名贵的中药材。研究表明,其主要次生代谢产物人参皂苷,在调节人的中枢神经系统、提高免疫力、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等方面有着很好的功效,因此被广泛用于药品、保健品、化妆品等各类产品中,具有可观的经济价值和广阔的应用前景。但是,由于野生人参资源匮乏、栽培周期长、人参品质易受环境影响等,导致高品质人参的市场供应量较少、价格昂贵。本研究主要是通过分析人参发根体细胞胚胎发生初期相关基因的表达情况,为进一步建立高效稳定的人参发根体细胞胚胎发生体系打下坚实的基础。人参发根是由发根农杆菌侵染人参根部诱导所产生的组织,以其为外植体进行人参体细胞胚胎发生具有诸多优点,这一技术已成为人参快速繁殖和种质创新的重要手段。在本研究,以人参发根为外植体进行愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导及继代培养,选定与植物体细胞胚发生相关的LBD家族、MAPK家族、WRKY家族转录因子中的LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因,利用半定量PCR及荧光实时定量PCR技术对以上基因在人参发根体细胞胚胎发生初期阶段的表达情况进行分析。本研究内容如下:1.以本实验室培养的人参发根为材料,进行发根继代培养、愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导和继代培养,得到实验所需的四种不同发育阶段的组织材料。2.根据植物体细胞胚胎发生的文献报道,查阅GenBank中其他植物相关基因的核酸序列,利用同源比对的方法设计引物,成功克隆人参5S rRNA基因及LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因核心片段并进行测序。3.通过半定量PCR研究6个目的基因在人参发根体细胞胚胎发生初期四种不同发育阶段的表达情况。选取人参5S rRNA基因为内参基因,对LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6和WRKY27基因表达情况进行半定量分析。半定量PCR结果显示,这6个基因在人参发根体细胞胚胎发生初期四种不同发育阶段的表达水平均存在明显差异,因此推测这6个基因与人参发根体细胞胚胎发生初期阶段相关。4.分别对6个目的基因的表达情况进行荧光实时定量PCR检测,荧光实时定量PCR结果与半定量PCR结果基本一致,进一步证实人参LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因与人参发根体细胞胚胎发生初期阶段相关。5.成功克隆得到人参WRKY6基因CDS序列。测序结果显示,人参WRKY6基因长度为1041bp,其与西洋参PqWRKY6核酸序列相似度为99.61%,氨基酸序列相似度为97.63%。生物信息学分析表明,该核酸片段为人参WRKY6基因CDS序列,命名为PgWRKY6并提交GenBank(检索号:KT277547.1)。
【关键词】：人参发根 胚胎发生 半定量PCR 荧光实时定量PCR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S567.51
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-22
• 1.1 研究的目的和意义10-11
• 1.2 人参体细胞胚胎发生11-12
• 1.2.1 人参组织培养的研究进展11
• 1.2.2 人参发根体胚发生的研究进展11-12
• 1.3 LBD基因家族12-13
• 1.3.1 LBD基因的结构及功能12
• 1.3.2 LBD基因与植物的生长发育12-13
• 1.4 MAPK基因家族13-15
• 1.4.1 MAPK参与植物生物及非生物胁迫响应14-15
• 1.4.2 MAPK参与植物激素的信号转导15
• 1.4.3 MAPK与植物生长发育相关15
• 1.5 WRKY转录因子15-18
• 1.5.1 WRKY参与植物生物和非生物胁迫响应16-17
• 1.5.2 WRKY参与植物激素的信号转导17
• 1.5.3 WRKY与植物生长发育相关17-18
• 1.6 植物生长发育与 2,4-D18-19
• 1.7 半定量PCR19
• 1.8 荧光实时定量PCR19-22
• 第2章 人参愈伤组织及胚性愈伤的诱导和增殖22-30
• 2.1 引言22
• 2.2 实验材料及仪器22-24
• 2.2.1 实验材料22-23
• 2.2.2 实验仪器23-24
• 2.3 实验方法24-26
• 2.3.1 人参发根继代培养24
• 2.3.2 2,4-D浓度与人参组织培养24-25
• 2.3.3 人参发根愈伤组织的诱导及增殖25
• 2.3.4 人参发根胚性愈伤组织的诱导及增殖25-26
• 2.4 结果与分析26-27
• 2.4.1 2,4-D浓度与人参组织培养26-27
• 2.4.2 人参组织培养27
• 2.5 讨论27-28
• 2.5.1 培养基的选择27-28
• 2.5.2 外源激素的添加28
• 2.6 小结28-30
• 第3章 人参体细胞胚胎发生初期相关基因的克隆30-48
• 3.1 引言30
• 3.2 实验材料及仪器30-32
• 3.2.1 实验材料30-31
• 3.2.2 实验仪器31-32
• 3.3 实验方法32-36
• 3.3.1 总RNA提取及c DNA合成32-33
• 3.3.2 引物设计33-34
• 3.3.3 基因的克隆与纯化34-36
• 3.3.4 基因测序及序列对比36
• 3.4 结果与分析36-46
• 3.4.1 总RNA提取及c DNA合成36-37
• 3.4.2 基因的克隆、纯化及测序37-46
• 3.5 讨论46-47
• 3.5.1 引物设计46
• 3.5.2 PCR反应条件的优化46-47
• 3.6 小结47-48
• 第4章 半定量PCR及荧光实时定量PCR48-62
• 4.1 引言48
• 4.2 实验材料及仪器48-49
• 4.2.1 实验材料48-49
• 4.2.2 实验仪器49
• 4.3 实验方法49-50
• 4.3.1 半定量PCR49
• 4.3.2 荧光实时定量PCR49-50
• 4.4 结果与分析50-59
• 4.4.1 5S rRNA内参基因50-51
• 4.4.2 LBD29基因51-52
• 4.4.3 MAPK4基因52-53
• 4.4.4 MAPK6基因53-55
• 4.4.5 WRKY3基因55-56
• 4.4.6 WRKY27基因56-57
• 4.4.7 WRKY6基因57-59
• 4.5 讨论59-60
• 4.5.1 RNA提取质量59-60
• 4.5.2 内参基因的选择60
• 4.5.3 反应循环数60
• 4.6 小结60-62
• 第5章 结论与展望62-64
• 5.1 结论62-63
• 5.2 展望63-64
• 参考文献64-70
• 在校期间科研成果70-71
• 致谢71

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