马铃薯StSnRK2基因家族启动子功能初步分析

发布时间：2017-06-07 07:14

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【摘要】：干旱、高盐、极温以及氧化胁迫都严重制约着植物的生长发育,导致作物产量下降以及品质不佳等问题的产生。为解决此类问题,各个国家的科学研究人员都有一个共同的目标,就是明确植物在逆境环境下产生的抵抗机制以及如何提高植物自身抵抗各种逆境的能力。蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2,SnRK2)是植物所特有的能够应答非生物胁迫的蛋白激酶。目前,马铃薯中的SnRK2基因家族的8个成员已经被克隆出来,分别为StSnRK2.1~2.8。启动子作为转录水平上的重要调控元件,在基因表达过程中发挥重要作用,其通过与多种转录因子相结合进而确定基因的表达模式及表达强度。目前,多种物种中的SnRK2基因家族的基因已被大量分离并对其功能有了一定的了解,但是对这一家族基因启动子的研究很少。本研究对StSnRK2转基因烟草进行抗逆性分析的同时,探究了SnRK2基因家族启动子在植物体内的表达特性,从马铃薯SnRK2基因家族中PCR扩增获得基因上游序列,对其做了初步的诱导功能分析。主要研究结果如下:1.对StSnRK2.3-、StSnRK2.5-、StSnRK2.6-和StSnRK2.8-转基因烟草在PEG和NaCl胁迫下的生物学特性和生理生化特性进行了研究,结果表明过表达StSnRK2.3、StSnRK2.5、StSnRK2.6和StSnRK2.8基因的转化烟草相较于非转基因烟草有明显的抗逆性,明确它们对烟草在干旱和盐逆境中的生存具有重要作用。2.利用常规PCR法,从马铃薯基因组中克隆得到基因翻译起始位点上游启动子序列,片段大小分别为977bp、961bp、855bp、932bp、766bp、763bp、686bp大小,命名为pStSnRK2.1、pStSnRK2.2、pStSnRK2.3、pStSnRK2.4、pStSnRK2.5、pStSnRK2.6、pStSnRK2.8。通过软件进行序列分析,结果表明这些启动子序列中不仅包含启动子的基本元件,还包含与非生物胁迫诱导相关的调控元件。3.为了分析SnRK2基因家族启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS报告基因嵌合的植物表达载体,本研究中成功构建四个启动子植物表达载体,分别为pBI121-pStSnRK2.3、pBI121-pStSnRK2.5、pBI121-pStSnRK2.6和pBI121-pStSnRK2.8。农杆菌介导转化烟草,经过一系列抗生素(卡那霉素)的筛选和PCR扩增验证,获得转基因植株。4.对pStSnRK2.3-、pStSnRK2.5-、pStSnRK2.6-和pStSnRK2.8-转基因烟草植株的不同植物组织进行GUS组织化学染色试验,结果显示它们都能在转基因烟草各组织(根、茎、叶)中观测到蓝色染色情况。进一步通过测量各组织的GUS酶活性,结果显示,在烟草植株的茎、叶和根中均有表达。表明这些启动子在转基因烟草中并不具有组织特异性,而且能够驱动基因稳定表达。5.对pStSnRK2.3-、pStSnRK2.5-、pStSnRK2.6-和pStSnRK2.8-转基因烟草植株进行非生物胁迫处理,检测GUS酶活性,结果显示它们在受到ABA、NaCl和PEG胁迫诱导后其活性各不相同。其中pStSnRK2.3对ABA和NaCl的诱导胁迫反应相对强烈,对PEG胁迫则反应微弱。pStSnRK2.5和pStSnRK2.8不响应ABA诱导激活,而强烈响应NaCl和PEG诱导。pStSnRK2.6不受ABA诱导激活,受NaCl和PEG的诱导激活,而且对NaCl的响应比对PEG的响应强烈。
【关键词】：马铃薯 StSnRK2基因 启动子 功能分析
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S532;Q943.2
【目录】：

• 摘要2-4
• Summary4-6
• 缩略词表6-9
• 第一章 文献综述9-18
• 1.1 植物响应非生物胁迫的机制9-10
• 1.1.1 植物蛋白激酶的功能机制9-10
• 1.1.2 植物蛋白激酶的类型10
• 1.2 SnRK2蛋白激酶家族10-12
• 1.2.1 SnRK2蛋白激酶家族的结构10-11
• 1.2.2 SnRK2基因家族的活性以及调控网络11
• 1.2.3 SnRK2蛋白激酶的研究进展11-12
• 1.2.4 马铃薯SnRK2蛋白激酶的研究12
• 1.3 植物基因启动子概述12-17
• 1.3.1 启动子类型13-14
• 1.3.2 植物启动子的核心结构及功能14-15
• 1.3.3 研究启动子的方法15-17
• 1.4 本研究的目的与意义17-18
• 第二章 StSnRK2-转基因烟草的抗逆性研究18-25
• 2.1 试验材料18
• 2.2 试验方法18
• 2.2.1 StSnRK2-转基因烟草的抗旱性和耐盐性分析18
• 2.2.2 相关生理指标的测定18
• 2.3 结果与分析18-22
• 2.3.1 转基因烟草的抗逆生物学特性分析18-19
• 2.3.2 StSnRK2-转基因烟草对渗透胁迫的响应19-22
• 2.4 讨论22-24
• 2.5 结论24-25
• 第三章 马铃薯StSnRK2基因启动子克隆与表达载体的构建25-41
• 3.1 试验材料、菌株和试剂25
• 3.2 试验方法25-30
• 3.2.1 马铃薯StSnRK2基因启动子的克隆与序列分析25-28
• 3.2.2 表达载体的构建和重组子的验证28-29
• 3.2.3 农杆菌感受态细胞的制备和转化29-30
• 3.3 结果与分析30-39
• 3.3.1 StSnRK2基因启动子的扩增30
• 3.3.2 StSnRK2基因启动子的序列分析30-36
• 3.3.3 StSnRK2基因启动子克隆载体重组子的验证36-37
• 3.3.4 StSnRK2基因启动子表达载体重组子的验证37-39
• 3.4 讨论39
• 3.5 结论39-41
• 第四章 StSnRK2基因启动子转化烟草及其功能分析41-54
• 4.1 试验材料41
• 4.2 试验方法41-43
• 4.2.1 植物表达载体pBI121-pStSnRK2转化烟草41
• 4.2.2 转基因烟草非生物胁迫处理41-42
• 4.2.3 GUS组织化学染色42
• 4.2.4 GUS酶活性的测定42-43
• 4.3 结果与分析43-50
• 4.3.1 植物表达载体导入农杆菌的验证43
• 4.3.2 转基因烟草的获得以及Kana抗性筛选转化植株43-46
• 4.3.3 StSnRK2基因启动子驱动GUS基因在转基因烟草中的稳定遗传表达46
• 4.3.4 StSnRK2基因启动子的诱导特性分析46-50
• 4.4 讨论50-53
• 4.4.1 StSnRK2基因启动子转基因烟草的组织特异表达51
• 4.4.2 非生物胁迫下pStSnRK2-转基因烟草的表达模式51-53
• 4.5 结论53-54
• 参考文献54-63
• 致谢63-64
• 作者简介64-65
• 导师简介65-66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 魏桂民;张金文;王蒂;张俊莲;陆艳梅;高宜峰;;马铃薯sgt2基因启动子的克隆及其活性分析[J];甘肃农业大学学报;2014年01期

2 胡鹏伟;何朝勇;洪岚;李玲;;AREB/ABF转录因子响应胁迫信号的网络调控[J];植物生理学报;2013年06期

3 王舟;刘建秀;;DREB/CBF类转录因子研究进展及其在草坪草和牧草抗逆基因工程中的应用[J];草业学报;2011年01期

4 陈t，

本文编号：428422