番木瓜果实成熟差异蛋白质组学研究及UBI基因克隆分析

发布时间：2017-06-11 09:08

  本文关键词：番木瓜果实成熟差异蛋白质组学研究及UBI基因克隆分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：番木瓜是番木瓜科(Caricaceae)番木瓜属(Carica L.)的多年生草本植物。作为典型的呼吸跃变型果实,番木瓜因采后迅速软化腐烂导致的损失制约了番木瓜产业的发展。目前,对番木瓜果实成熟机理的研究主要集中在生理水平及转基因方面,对番木瓜果实发育成熟过程的蛋白质组学的研究尚在起步阶段。本研究以0.5μL/L乙烯利和1μL/L的1-MCP处理的番木瓜果实作为研究材料,对番木瓜果实的差异蛋白质组学和UBI家族基因在果实成熟过程中的功能进行探究。从基因和蛋白水平研究乙烯和1-MCP调控番木瓜果实成熟的过程,可以更加全面的了解果实成熟的分子机制,且对果实贮藏保鲜技术的研发具有重要的指导意义。本研究主要结果如下：(1)乙烯利和1-MCP处理后的番木瓜果实,其果皮颜色、硬度、果实的丙二醛含量、过氧化物酶活性以及可溶性蛋白含量在处理后12h到24h之间表现出差异,而可溶性固形物在处理后的变化不明显,说明番木瓜果实的中糖、维生素、番木瓜碱等营养成分含量可能在绿熟期就已达到高峰。(2)采用酚抽提取法和iTRAQ技术对处理后24h的果肉蛋白进行提取鉴定。总共得到二级图谱数为217907,匹配到的谱图数为16957张,其中匹配到特有的肽段的谱图数量是8842张,鉴定到的肽段数及特有肽段序列分别为6582和3853,其中鉴定到3048种蛋白质。通过对番木瓜果实iTRAQ技术蛋白质谱表达分析：三个处理中总共得到192种差异蛋白,其中上调蛋白有79种,下调蛋白有113种。其中乙烯/CK上调蛋白49个,下调蛋白73个,1-MCP/CK上调蛋白30个,下调蛋白40个。(3)乙烯/CK和1-MCP/CK的差异蛋白共同参与的显著富集代谢途径是基本代谢途径与糖酵解和糖异生途径,其中乙烯/CK代谢途径涉及55种蛋白,占差异蛋白总数的51.89%,1-MCP/CK涉及38种蛋白,占差异蛋白总数的62.3%：糖酵解和糖异生途径乙烯/CK涉及14种蛋白,占差异蛋白总数的13.21%,1-MCP/CK涉及8种蛋白,占差异蛋白总数的13.11%。(4)通过GO富集分析,得到一些与果实成熟软化相关的关键蛋白,糖类代谢过程中的尿苷二磷酸糖基转移酶、烯醇酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和α-淀粉酶等,细胞结构相关的蛋白有木葡聚糖内糖基转移酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和磷脂酶D等,蛋白水解及合成相关蛋白木瓜蛋白酶、蛋白二硫化物歧化酶等,参与胁迫响应与防御相关的蛋白抗坏血酸还原酶、水通道蛋白等,乙烯生物合成相关蛋白蛋氨酸合成酶。(5)选取6个差异蛋白在mRNA的水平上进行验证,得到66.7%的基因表达规律与蛋白质表达规律相一致。其中,α-淀粉酶1、蛋氨酸合成酶、尿苷二磷酸糖基转移酶和半胱氨酸蛋白酶在1-MCP和乙烯处理后的番木瓜果实中表达在转录水平的表达具有相似性。而α-淀粉酶2在乙烯和1-MCP处理中蛋白表达与mRNA水平完全相反,木葡聚糖内糖基转移酶在乙烯处理后的果实中蛋白质水平表现为下调,而转录水平表现为上调,但是在1-MCP处理中,蛋白表达与mRNA表达相一致,均为上调。(6)为探究番木瓜泛素家族成员的序列特征及表达模式,采用RT-PCR克隆出3个泛素基因,其开放阅读框(ORF)分别编码306、308和156个氨基酸,分别命名为CpUBI1、CpUBI2和CpUBI3。序列分析结果表明CpUBI1和CpUBI2含有4个连续的UBQ Superfamily结构域,属于多聚泛素家族基因,CpUBI3有一个UBQ Superfamily和Ribosomal S27a Superfamily结构域,属于S27a泛素延伸蛋白家族基因。采用实时荧光定量PCR研究其在乙烯利、1-MC及清水对照处理后果实中的表达情况,发现CpUBI1和CpUBI2的表达量显著高于CpUBI3,且乙烯利处理的番木瓜果实中三个泛素基因表达量均上调,推测多聚泛素基因受乙烯的诱导增加表达量,从而参与调控番木瓜果实的成熟衰老。
【关键词】：番木瓜 iTRAQ 果实成熟 乙烯 1-MCP 泛素家族基因
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S667.9
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩略词表11-12
• 第一章 文献综述12-19
• 1 国内外的研究现状13-15
• 1.1 乙烯与1-MCP在番木瓜果实成熟软化中的研究13
• 1.2 番木瓜果实贮藏保鲜技术的研究13-15
• 2 蛋白质组学在果实软化机理中的应用15-17
• 2.1 蛋白质组学概述15
• 2.2 iTRAQ技术及其在蛋白质组学上的应用15-16
• 2.3 蛋白质组学在果实成熟衰老研究中的应用16-17
• 3 泛素基因功能的研究进展17
• 4 本文的研究目的和内容17-19
• 4.1 目的和意义17-18
• 4.2 主要研究内容18-19
• 第二章 乙烯与1-MCP处理采后番木瓜果实的品质变化19-27
• 1 材料与方法19
• 1.1 植物材料19
• 1.2 方法19-21
• 1.2.1 果皮颜色的观察记录19
• 1.2.2 果实硬度的测定19
• 1.2.3 可溶性固形物含量的测定19-20
• 1.2.4 过氧化物酶活性的测定20
• 1.2.5 丙二醛含量的测定20
• 1.2.6 可溶性蛋白的测定20-21
• 2 结果与分析21-25
• 2.1 不同处理后番木瓜果皮颜色的变化21
• 2.2 不同处理后番木瓜果实硬度的变化21-22
• 2.3 不同处理后番木瓜果实可溶性固形物的变化22-23
• 2.4 不同处理后番木瓜果实丙二醛(MDA)变化23-24
• 2.5 不同处理后番木瓜果实过氧化物酶(POD)活性的变化24
• 2.6 不同处理后番木瓜果实可溶性蛋白含量的变化24-25
• 3 讨论25-27
• 第三章 乙烯与1-MCP处理后番木瓜果实的差异蛋白质组学27-47
• 1 材料与方法27-30
• 1.1 番木瓜果实蛋白提取27
• 1.2 蛋白质浓度测定27-28
• 1.3 SDS电泳28
• 1.4 蛋白质酶解28
• 1.5 iTRAQ标记28
• 1.6 SCX分离28
• 1.7 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析28-29
• 1.8 蛋白数据的选择与分析29
• 1.9 实时荧光定量PCR分析29-30
• 2 结果与分析30-43
• 2.1 番木瓜果实蛋白质的定量分析30-31
• 2.2 SDS-PAGE电泳鉴定蛋白质质量31-32
• 2.3 蛋白鉴定质量评估32-33
• 2.4 iTRAQ测序结果33-34
• 2.5 蛋白质组所有基因的功能分类34-36
• 2.6 差异蛋白的确定36-37
• 2.7 差异蛋白的GO富集分析37-38
• 2.8 差异蛋白KEGG Pathway代谢通路注释38-40
• 2.9 荧光定量RT-qPCR验证40-43
• 3 讨论43-47
• 3.1 番木瓜果实蛋白质组分的分析43-44
• 3.2 番木瓜果实成熟过程中参与糖类代谢过程的相关蛋白44-45
• 3.3 番木瓜果实成熟过程中参与细胞结构相关的蛋白45
• 3.4 番木瓜果实成熟过程中参与蛋白水解及合成相关蛋白45-46
• 3.5 番木瓜果实成熟过程中参与水分代谢相关的蛋白46
• 3.6 差异蛋白质表达量验证46-47
• 第四章 番木瓜果实UBI基因的克隆与分析47-56
• 1 材料与方法47-49
• 1.1 材料与试剂47
• 1.2 总RNA提取及cDNA的合成47-48
• 1.3 泛素家族基因cDNA克隆48
• 1.4 生物信息学分析48
• 1.5 泛素家族基因在不同处理的番木瓜果肉中的表达分析48-49
• 2 结果与分析49-54
• 2.1 泛素家族基因的克隆与序列分析49-50
• 2.2 CpUBI家族基因的多重序列比对及系统进化分析50-52
• 2.3 CpUBI家族基因的蛋白结构分析52-53
• 2.4 CpUBI家族基因在番木瓜不同成熟时期的表达53-54
• 3 讨论54-56
• 第五章 小结与展望56-58
• 1 小结56-57
• 2 展望57-58
• 参考文献58-70
• 附录1 蛋白质相对分子质量分布70
• 附录2 番木瓜果实蛋白质丰度比分布图70-71
• 附录3 差异蛋白的GO富集分析71-88
• 致谢88

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