奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

发布时间：2017-06-14 16:07

  本文关键词：奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。
【作者单位】： 河南农业大学牧医工程学院/农业部动物生化与营养重点实验室;
【关键词】： 奶牛 固醇调节元件结合蛋白 乳腺上皮细胞 亚细胞定位 转录调控
【基金】：国家“973”项目(2011CB100802) 国家自然科学基金(31072009) 国家转基因重大专项(2014ZX0801015B) 河南省高等学校重点科研项目(15A230020) 河南省基础与前沿项目(162300410258)
【分类号】：S823
【正文快照】： Expression and Localization of Bovine SREBP1 Protein andRegulation of the Transcription of SCD1 Promoter in BovineMammary Epithelial CellHAN Li-qiang,WANG Yue-ying,WANG Lin-feng,ZHU He-shui,ZHONG Kai,CHU Bei-bei,YANG Guo-yu(College of Animal Science and

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王月影;朱河水;王艳玲;;乳腺上皮细胞的钙转运研究进展[J];江西农业学报;2008年06期

2 杨栎;李键;吴媛媛;田甜;毕琳;梁天宇;;绿色荧光蛋白基因在牦牛乳腺上皮细胞中表达的研究[J];西南民族大学学报(自然科学版);2009年03期

3 吴媛媛;李键;杨栎;毕琳;田甜;;牦牛乳腺上皮细胞的体外培养的研究[J];西南民族大学学报(自然科学版);2009年04期

4 弓超;王凌云;周欢敏;;牛乳腺上皮细胞体外分离和培养[J];动物医学进展;2011年07期

5 李吉霞;葛秀国;王文秀;张涌;;牛乳腺上皮细胞的分离培养[J];黑龙江畜牧兽医;2012年07期

6 符梅;熊显荣;高川;李宇;王树茂;李键;;麦洼牦牛乳腺上皮细胞系的建立及其生物学特性[J];西北农业学报;2012年11期

7 郝明超;刘r

本文编号：449896