猪圆环病毒2型ORF2基因与猪瘟病毒E2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达与生物活性的鉴定

发布时间：2017-06-16 17:01

  本文关键词：猪圆环病毒2型ORF2基因与猪瘟病毒E2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达与生物活性的鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：动物乳腺生物反应器技术就是利用乳腺特异性表达载体,将我们所需要的目的蛋白通过动物的乳汁表达出来。通过动物乳腺所生产的蛋白经过了动物乳腺的一系列修饰过后,不仅生物安全性高,且生产量也有了很大的提升,因此可将我们所需要的蛋白进行批量化生产。猪圆环病毒,是目前已知的最小的动物病毒之一,可与多种真菌或病毒混合感染,从而引起猪的肾病综合征、皮炎、母猪繁育障碍等疾病。猪圆环病毒属于圆环病毒科,分为PCV-1与PCV-2两种血清类型,其中PCV-2为致病性血清。PCV-2基因组全长为1.76 kb,包含11个ORF开放阅读框,ORF2在其分子机制中发挥了很重要的作用,因其主要编码PCV-2的Cap蛋白。Cap蛋白为猪圆环病毒的主要免疫原性物质,因此主要对PCV-2的第二个阅读框的进行研究。现已有实验证明其可以诱导机体产生保护性的抗体,在猪圆环病毒的防控与治疗中起着重要的作用。猪瘟病毒被动物国际卫生组织列为A类的传染性疾病,致死率非常高,约为80%至90%,对养猪的影响非常巨大,并且造成了巨大的经济损失。猪瘟病毒的基因序列全长约为12.3Kbp,是单股正链的RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属。猪瘟疾病主要是由猪瘟病毒所引起,其中E2基因所编码的囊膜糖蛋白能与抗原决定簇进行中和反应,并且为猪瘟病毒的主要保护性抗原,能促使机体产生抵抗病毒的攻击。因此E2囊膜蛋白一直被用于猪瘟病毒的防治过程中的主要研究,也成为近几年来新型疫苗的与抗原检测的主要靶基因。为获得稳定表达猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因与CSFV-E2基因的奶山羊胎儿成纤维细胞,本研究分别将PCV-2-ORF2基因与CSFV-E2基因分别与筛选基因NEO表达框串联插入p BC1质粒,得到重组真核表达载体p BC1-ORF2-NEO与p BC1-E2-NEO。并采用脂质体介导法转染至奶山羊胎儿成纤维细胞(g FFs)中,经G418筛选获得具有稳定抗性的g FFs细胞株。经RT-PCR分析显示,在获得的g FFs细胞株中能够扩增689bp的ORF2基因与1131bp的E2基因和1953bp的NEO表达框,与预期的结果相符。Western-blot分析显示,获得了约36ku与42ku的表达产物,且能够与兔抗PCV-2 Cap与兔抗CSFV-E2囊膜蛋白抗体发生反应。结果表明,ORF2基因与E2基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞染色体上并得到正确表达,表达产物具有良好的反应原性,这为构建分泌Cap蛋白与E2囊膜蛋白的奶山羊乳腺生物反应器奠定了理论和物质基础。
【关键词】：猪圆环病毒 猪瘟病毒 乳腺表达载体 奶山羊 胎儿成纤维细胞 转染
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• SUMMARY5-9
• 缩略词对照表9-11
• 第一章 文献综述11-23
• 1 引言11-12
• 2 乳腺生物反应器12-16
• 2.1 乳腺生物反应器技术12-13
• 2.2 乳腺生物反应器的发展历程13
• 2.3 乳腺生物反应器的优点13-14
• 2.4 影响外源蛋白高表达的因素14
• 2.5 基因打靶载体在乳腺表达载体中的应用14
• 2.6 乳腺特异表达载体的主要结构组成14-15
• 2.7 β-乳球蛋白基因在乳腺特异载体中的应用15
• 2.8 乳腺生物反应器的发展中存在的问题15
• 2.9 乳腺生物反应器的发展前景15-16
• 3 猪圆环病毒PCV2的研究16-19
• 3.1 猪圆环病毒的相关病原学16
• 3.2 猪圆环病毒在世界范围内的流行状况16
• 3.3 猪圆环病毒的检测方法16-17
• 3.4 猪圆环病毒的诊断标准17
• 3.5 实验室诊断猪圆环病毒的方法17
• 3.6 猪圆环病毒的主要结构17-18
• 3.7 Cap蛋白的作用机制18
• 3.8 ORF2基因的作用机制18
• 3.9 猪圆环病毒疫苗的国内及国外研究进展18-19
• 4 猪瘟病毒CSFV的研究19-22
• 4.1 猪瘟病毒的相关病原学19
• 4.2 猪瘟病毒的流行现状19
• 4.3 猪瘟病毒的检测方法19-20
• 4.4 猪瘟病毒所编码的蛋白20
• 4.5 猪瘟病毒E2囊膜蛋白的作用机制20-21
• 4.6 猪瘟病毒疫苗的发展历程21
• 4.7 我国猪瘟病毒的预防与治疗21
• 4.8 我国猪瘟病毒研究中存在的问题21-22
• 5.本研究的目的及主要内容22-23
• 第二章 猪圆环病毒ORF2基因与猪瘟病毒E2基因的PBC1乳腺特异表达载体的构建。23-35
• 1 材料与方法23-30
• 1.1 材料23-24
• 1.2 实验方法24-30
• 2 结果30-35
• 2.1 目的基因PCV2-ORF2与CSFV-E2的扩增30-32
• 2.2 重组载体p BC1-ORF2与p BC1-E2载体的酶切鉴定32-33
• 2.3 重组载体p BC1-ORF2-NEO与p BC1-E2-NEO载体的酶切鉴定33-35
• 3 讨论35
• 第三章 乳腺特异表达载体PBC1-ORF2-NEO与PBC1-E2-NEO在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达与生物活性的鉴定35-51
• 1 材料与方法36-43
• 1.1 材料36-37
• 1.2 方法37-43
• 2 结果43-48
• 2.1 重组质粒p BC1-ORF2-NEO转染奶山羊胎儿成纤维细胞的观察43-44
• 2.2 重组质粒p BC1- E2-NEO转染奶山羊胎儿成纤维细胞的观察44
• 2.3 RT-PCR检测重组质粒p BC1-ORF2-NEO在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达44-45
• 2.4 RT-PCR检测重组质粒p BC1-E2-NEO在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达45-46
• 2.5 Western blot检测CAP蛋白与E2囊膜蛋白的表达46-48
• 3 讨论48-51
• 结论51-52
• 参考文献52-58
• 致谢58-60
• 导师简介60-61
• 作者简介61-62

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