毛竹全长均一化cDNA文库构建与快速生长相关基因的筛选

发布时间：2017-06-18 09:13

  本文关键词：毛竹全长均一化cDNA文库构建与快速生长相关基因的筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：毛竹是我国森林资源中分布最广、面积最大、用途最多的竹种,在竹业生产中占有十分重要的地位,具有极高的经济价值、生态价值和文化价值,毛竹的生长速度非常快,在天然状态下,从幼竹出土长至20米的幼竹秆形仅需45-60天,其生长高峰期时一昼夜生长高度可达1米以上,这么快的生长速度很难在其他非竹类植物群中见到。前人利用显微技术、高通量测序及蛋白组学研究方法已获得部分毛竹快速生长相关结构、激素水平、特异基因信息。但毛竹遗传转化体系尚未系统建立,毛竹优势基因功能亟待系统发掘与研究。日本理化研究所Minami Matsui博士在2009年构建水稻全长cDNA文库并将水稻基因大规模在拟南芥中过表达以研究水稻基因功能,并命名其为FOX(Full-length Overexpress)过表达体系。此外,我国重要林木物种如马尾松、杉木等生长缓慢、周期长,如何缩短林木生产周期、提升生长速度一直是我国林业生产的重要目标。因此,筛选与开发通用快速生长毛竹基因具有重要意义。因此,本项目借助最新的In-fusion技术及均一化关键酶DSN (Duplex specific nuclease),自主研发并初步建立了毛竹全长均一化cDNA文库,通过水平基因转移技术将其在双子叶植物拟南芥中大规模随机过表达,以期筛选单双子叶植物通用的快速生长基因。利用毛竹基因过表达的拟南芥株系筛选出叶形特异(40株)、茎秆特异(10株)、矮小(23株)、早花(12株)、晚花(25株)与快速生长(10株)等多类表型。并比对与获取36个与拟南芥表型相关的毛竹基因,进一步筛选单拷贝插入的纯合突变体,以期筛选单双子叶通用快速生长基因,探讨植物快速生长分子机制,为后续林业生长应用提供理论基础与资源积累。
【关键词】：毛竹 均-化-cDNA文库 过表达 拟南芥 快速生长 表型
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S795.7
【目录】：

• 摘要9-10
• Abstract10-12
• 第一章 绪论12-20
• 1.1 引言12-13
• 1.1.1 研究背景12-13
• 1.1.2 研究目的和意义13
• 1.1.3 研究内容13
• 1.2 国内外研究现状与综述13-17
• 1.2.1 毛竹的形态结构学研究进展13-14
• 1.2.2 毛竹茎秆发育研究进展14-15
• 1.2.3 毛竹快速生长机理研究进展15-16
• 1.2.4 采用文库筛选基因的研究现状16-17
• 1.3 研究目标和主要内容17-18
• 1.3.1 研究目标17
• 1.3.2 主要研究方法17-18
• 1.4 工作软硬件基础18-19
• 1.5 技术路线19-20
• 第二章 毛竹全长均一化cDNA文库的构建20-35
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 取样地概括20-21
• 2.1.2 样本采集21
• 2.1.3 培养基配制21
• 2.1.4 载体扩繁21-22
• 2.2 实验方法22-29
• 2.2.1 总RNA提取22-23
• 2.2.2 逆转录反应23
• 2.2.3 全长cDNA第二链合成23-24
• 2.2.4 全长cDNA均一化处理24-25
• 2.2.5 均一化cDNA的扩增与胶回收25-26
• 2.2.6 全长均一化cDNA扩增产物与表达载体的连接26-27
• 2.2.7 连接产物纯化27-28
• 2.2.8 连接产物电击转化与涂平板28
• 2.2.9 挑取单克隆验证插入片段大小28
• 2.2.10 刮板与提取质粒28-29
• 2.3 结果与分析29-33
• 2.3.1 总RNA提取29
• 2.3.2 双链cDNA合成29-31
• 2.3.3 DNA均一化处理结果比较31
• 2.3.4 In-fusion反应31
• 2.3.5 电转化结果比较31-32
• 2.3.6 文库单克隆验证32-33
• 2.4 讨论33-35
• 2.4.1 RNA质量是文库构建成败的前提条件33-34
• 2.4.2 DSN处理过程需要谨慎34
• 2.4.3 In-fusion效率受PCR产物大小的影响34
• 2.4.4 In-fusion产物的纯化有利于电击转化34-35
• 第三章 毛竹均一化cDNA文库的拟南芥转化35-42
• 3.1 实验材料36-37
• 3.1.1 农杆菌电击感受态的制备36
• 3.1.2 拟南芥的种植36-37
• 3.2 实验方法37-38
• 3.2.1 农杆菌的电击转化37
• 3.2.2 农杆菌侵染拟南芥37-38
• 3.2.3 拟南芥的管理38
• 3.3 结果与讨论38-42
• 3.3.1 农杆菌的培养38-39
• 3.3.2 拟南芥的种植与转化39
• 3.3.3 讨论39-42
• 第四章 T1代种子的阳性筛选42-46
• 4.1 实验材料43
• 4.2 方法43
• 4.2.1 种子“层积”处理43
• 4.2.2 阳性苗的抗Basta筛选43
• 4.3 结果分析43-46
• 4.3.1 结果43-44
• 4.3.2 分析44-46
• 第五章 T1代转基因拟南芥表型的鉴定46-60
• 5.1 实验材料46
• 5.2 实验方法46-58
• 5.2.1 表型观察46-47
• 5.2.2 快速生长相关表型分类47-54
• 5.2.3 毛竹插入基因的鉴定54-58
• 5.3 结果与分析58-60
• 第六章 纯合子鉴定60-63
• 6.1 T2代种子的basta筛选60-62
• 6.1.1 1/2 MS培养基筛选60
• 6.1.2 移苗培养60-62
• 6.2 T3代种子培养基筛选62-63
• 6.2.1 T3代种子basta筛选62
• 6.2.2 移苗培养62-63
• 第七章 结论与展望63-65
• 7.1 结果与讨论63-64
• 7.2 展望64-65
• 参考文献65-71
• 附录71-85
• 致谢85

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 王涛涛;毛竹全长均一化cDNA文库构建与快速生长相关基因的筛选[D];福建农林大学;2016年

  本文关键词：毛竹全长均一化cDNA文库构建与快速生长相关基因的筛选，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：458711