海滨锦葵KpCHX基因在拟南芥中的功能验证

发布时间：2017-06-23 14:17

  本文关键词：海滨锦葵KpCHX基因在拟南芥中的功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：盐胁迫也被认为是一种高离子含量胁迫。盐胁迫主要影响的是暴露于盐渍土的植物组织中Na~+、Cl-的积累。Na~+和Cl-的大量的吸收导致严重离子含量失去平衡,而高浓度Na~+会抑制K~+吸收,K~+是对植物生长和发育都很重要的元素,K~+浓度过低会导致植物产量降低甚至死亡。海滨锦葵是一种双子叶盐土植物,最高能够耐受420 mM NaCl的高盐环境,并产生可育的种子,其耐盐性主要依赖于控制Na~+、K~+和Cl-的吸收和分配以及有机溶剂的合成。海滨锦葵KpCHX基因,是CHX(cation/H+exchanger family)家族的一个成员,研究表明KpCHX基因在盐胁迫下在植物根部上调表达。因此,我们推测KpCHX基因可能与海滨锦葵的耐盐性有关。另外,KpCHX与拟南芥AtCHX17-20同源很高,尤其是与AtCHX17高度同源,而AtCHX17被证明是参与K~+吸收和平衡的一种转运蛋白,所以我们推测AtCHX17可能参与植物体内K~+平衡。为了验证KpCHX基因在植物耐盐性和K~+中的作用,我们通过Gateway技术,构建了6个2×35S KpCHX Nos超表达载体,转入农杆菌GV3101,然后通过蘸花法转化哥伦比亚野生型拟南芥,收获的转基因种子通过潮霉素抗性平板筛选出转基因T1、T2、T3代;再通过分子水平验证基因表达,先是DNA水平,通过PCR验证目的基因成功整合至拟南芥基因组的转基因株系,再通过蛋白水平的SDS-PAGE,Western blot分析目的蛋白成功表达的转基因株系--C45转基因拟南芥。最后再进行基因功能验证,通过耐盐处理和指标测定,结果表明C45转基因拟南芥的根长、叶片数、鲜重、干重均大于WT野生型拟南芥,脯氨酸含量和丙二醛含量的测定结果表明C45转基因拟南芥耐盐性要高于WT野生型拟南芥。将WT和C45培养在K~+不足的环境中进行K~+缺乏处理,发现WT野生型拟南芥生长萎蔫,叶片凋零,而C45转基因拟南芥生长旺盛。测定C45转基因拟南芥的根长、叶片数、分枝数、鲜重、干重,结果均大于WT野生型拟南芥,表明在K~+不足环境下,C45转基因拟南芥长势较好。总而言之,本实验得出以下结论:(1)转KpCHX基因可以提高拟南芥耐盐性;(2)转KpCHX基因可以促进拟南芥在K~+不足环境下的生长。
【关键词】：海滨锦葵 KpCHX 拟南芥 耐盐性 K~+转运
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 引言10-23
• 1.1 海滨锦葵概述10-11
• 1.2 植物耐盐性概述11-15
• 1.2.1 盐胁迫对植物的伤害11-12
• 1.2.2 盐生植物对盐胁迫的适应性12
• 1.2.3 植物耐盐机理12-15
• 1.3 CHX基因概述15-17
• 1.4 海滨锦葵耐盐机理研究进展17-18
• 1.5 KpCHX研究进展18-21
• 1.6 本研究的目的与意义21-23
• 第二章 KpCHX超表达载体构建与转化23-32
• 2.1 Gateway技术和蘸花法概述23-25
• 2.1.1 Gateway克隆技术23-24
• 2.1.3 农杆菌介导蘸花法24-25
• 2.2 植物材料及培养25
• 2.3 植物表达载体的构建25-28
• 2.3.1 大肠杆菌DH5α 感受态细胞制备25-26
• 2.3.2 创建入门载体26
• 2.3.3 转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞26-27
• 2.3.4 构建表达载体27-28
• 2.4 蘸花法转化野生型拟南芥28-29
• 2.4.1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备与转化28
• 2.4.2 蘸花法转化拟南芥28-29
• 2.5 结果29-31
• 2.5.1 创建入门载体29-30
• 2.5.2 重组质粒提取30-31
• 2.5.3 构建表达载体31
• 2.6 本章小结31-32
• 第三章 转KpCHX基因拟南芥的筛选与鉴定32-45
• 3.1 植物材料及培养32-33
• 3.2 转基因拟南芥筛选33-35
• 3.2.1 T1代转基因株系筛选33
• 3.2.2 T2代转基因株系筛选33-34
• 3.2.3 T3代转基因株系筛选34-35
• 3.3 转基因株系的鉴定35-39
• 3.3.1 Western Blot鉴定转基因株系中KpCHX蛋白表达35-38
• 3.3.2 荧光显微镜观察KpCHX表达位置38-39
• 3.4 结果39-44
• 3.4.1 转基因后代筛选39-40
• 3.4.3 Western Blot验证KpCHX蛋白表达40-43
• 3.4.4 荧光显微镜观察KpCHX定位于根部细胞膜（或壁）43-44
• 3.5 本章小结44-45
• 第四章 转KpCHX基因拟南芥功能验证45-55
• 4.1 植物材料及培养45
• 4.2 转KpCHX基因拟南芥耐盐性验证45-48
• 4.2.1 盐处理下发芽率测定45
• 4.2.2 盐处理下根长、长势测定45
• 4.2.3 盐处理生长、生理指标测定45-48
• 4.3 KpCHX与K~+转运相关功能验证48
• 4.4 主要结果48-54
• 4.4.1 盐处理下转基因拟南芥与WT发芽率一致48-49
• 4.4.2 盐处理下转KpCHX基因促进拟南芥根长延伸49-50
• 4.4.3 盐处理转Kp CHX基因提高转基因拟南芥耐盐性50-52
• 4.4.4 转KpCHX基因促进转基因拟南芥在K~+不足的环境下生长52-54
• 4.5 本章小结54-55
• 第五章 结论与讨论55-58
• 5.1 主要结论55
• 5.2 讨论55-58
• 主要试剂和仪器58-63
• 参考文献63-71
• 个人简历71-72
• 致谢72

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  本文关键词：海滨锦葵KpCHX基因在拟南芥中的功能验证，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：475334