CSFV、BVDV双重RT-PCR检测方法的建立及E2基因遗传进化分析

发布时间：2017-06-23 22:03

  本文关键词：CSFV、BVDV双重RT-PCR检测方法的建立及E2基因遗传进化分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪瘟(Classical Swine Fever Virus,CSFV),牛病毒性腹泻(Bovine Viral Diarrhoea Virus,BVDV)均属于黄病毒科瘟病毒属成员,它们在结构与抗原性方面具有相似性性,能够产生交叉免疫学反应与交叉保护作用。由于这两者都能感染猪,严重影响我国畜牧业的健康发展。CSFV主要感染猪,BVDV不仅能感染小反刍而且能感染家畜,其中怀孕母猪和仔猪最易感,其病理变化与临床症状与慢性猪瘟类似。这不仅对该病的防制带来一定的困扰且对本病的判断带来困难。从核苷酸同源性来看,BVDV与CSFV的核苷酸同源性约为60%,由于在血清学上存在交叉反应,容易与猪瘟相混淆,对该疾病的诊断带来影响。近年来,我国猪瘟在临床表现不典型,出现了所谓的“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”,这些所谓的不典型猪瘟病理剖检上也和典型猪瘟不相同。原因主要有以下两点,一方面可能是我国长期疫苗防控,使得猪瘟病毒在免疫压力下造成了免疫耐受,改变毒力和抗原的某些特性,另一方面可能是猪只在感染CSFV的同时感染了BVDV,两者加剧了病毒的危害,对我国养殖业造成灾难性的打击。因此对猪感染BVDV的现状必须有清醒的认识并应采取必要的防范措施,并且在疫苗生产过程中,要避免疫苗中BVDV的污染。根据当前猪瘟的这种变化,并且这两种病毒感染猪后所长生的症状及其相似,临床上通过症状很难鉴别诊断这两种病毒。及时的鉴别诊断有助于后期猪场人员对这两种病毒防控,有必要建立一种能够同时对CSFV和BVDV进行鉴别检测的方法。因此,本文开展以下几个方面的研究:(1)使用MGEA4.0软件比对分析CSFV,BVDV的核苷酸序列,寻找各自的特异性保守区并设计各自的特异性引物;(2)通过改变PCR过程中的退火温度,优化CSFV,BVDV各自的最佳退火温度;(3)使用优化好的退火温度,对CSFV,BVDV以及猪场常见的几种病毒进行特异性检测;(4)通过不断改变CSVF,BVDV的浓度,检测能够扩增CSFV,BVDV的最低核酸浓度,验证引物的敏感性;(5)通过双重RT-PCR检测,最后检验CSFV,BVDV特异性引物所扩增的结果是否与预期结果相符。
【关键词】：CSFV BVDV 序列比对 RT-PCR
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 英文缩写对照表6-9
• 1 前言9-16
• 1.1 牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒的分类及分子结构以及理化特征9-11
• 1.2 BVDV与CSFV的流行概况11-12
• 1.3 BVDV与CSFV的检测技术12-13
• 1.4 猪感染BVDV的调查13-14
• 1.5 CSFV，BVDV的鉴别诊断方法14-15
• 1.6 本研究的目的和意义15-16
• 2 材料和方法16-29
• 2.1 材料16-18
• 2.1.1 常用软件及生物信息学网站16
• 2.1.2 菌株、毒株、载体、细胞株16
• 2.1.3 常用酶类及试剂盒16
• 2.1.4 其他主要试剂16
• 2.1.5 主要实验耗材16
• 2.1.6 实验室主要仪器设备16-17
• 2.1.7 常用试剂的配置17-18
• 2.2 方法18-29
• 2.2.1 基因序列的下载与比对18
• 2.2.2 CSFV，BVDV的培养18-19
• 2.2.2.1 PK-15，MDBK 细胞的复苏18
• 2.2.2.2 PK-15，MDBK 细胞的传代18-19
• 2.2.2.3 BVDV，CSFV的扩增19
• 2.2.3 病毒核酸的提取及浓度的检测19-20
• 2.2.4 CSFV，BVDV的RT-PCR条件的优化20-21
• 2.2.5 CSFV，BVDV的特异性RT-PCR实验21-22
• 2.2.6 CSFV，BVDV的敏感性RT-PCR检测22-24
• 2.2.7 CSFV，BVDV的双重RT-PCR检测24-25
• 2.2.8 双重RT-PCR产物的纯化25-26
• 2.2.9 RT-PCR产物与p MD 19-T载体的连接26
• 2.2.10 DH5α 感受态细胞的制备26-27
• 2.2.11 连接产物转化DH5α 感受态细胞27
• 2.2.12 重组质粒的菌液PCR鉴定和阳性质粒的抽提27-29
• 2.2.13 CSFV，BVDV菌液PCR结果的测序29
• 3 实验结果与分析29-34
• 3.1 CSFV，BVDV的RT-PCR条件的优化29-30
• 3.2 CSFV，BVDV的特异性RT-PCR实验30-31
• 3.3 CSFV，BVDV的敏感性RT-PCR检测31-32
• 3.4 CSFV，BVDV的双重RT-PCR检测32
• 3.5 CSFV，BVDV的菌液RCR检测32-33
• 3.6 临床样品检测33-34
• 4 讨论与结论34-36
• 4.1 序列的比对34-35
• 4.2 特异性检测35
• 4.3 结论35-36
• 全文总结36-37
• 致谢37-38
• 参考文献38-42

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 尹双辉;尚佑军;刘艳红;蔺芳;才学鹏;刘湘涛;;可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立[J];中国兽医学报;2009年12期

2 张宁;秦建华;赵博伟;张富梅;胡晓悦;赵月兰;;牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展[J];动物医学进展;2008年02期

3 舒黛廉,邢钊;牛病毒性腹泻—黏膜病(BVD-MD)研究进展[J];中兽医学杂志;2004年03期

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本文编号：476384