可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的建立鉴定及表型分析

发布时间：2017-06-25 13:04

  本文关键词：可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的建立鉴定及表型分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的哺乳动物的精子发生是一个高度复杂的细胞分裂与分化过程,许多生精细胞特异性基因的表达和调控具有发育阶段特异性的特征,任一阶段的异常都有可能导致雄性不育,因此,研究精子发生过程中起重要作用的睾丸特异性基因,并对这些基因的表达特征及其在精子发生过程中所起的生物学功能进行深入研究,对理解精子发生的内在机理、防治精子发生异常引起的男性不育、研制男性避孕药及保健药等具有重要意义。Speedy/Ringo基因是一类新发现的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)激活因子,在精子发生过程中起重要作用。利用四环素(tetracycline, Tet)基因调控表达系统可以在时间和空间上实现对基因的可控性表达,为基因功能的研究提供有效的解决途径。本文旨在建立基于Tet-On系统诱导表达的Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,研究Speedy A基因表达下调对精子发生的影响,并且探讨Tet-On系统在研究精子发生相关基因中的应用。方怯利用生物信息学软件,按照RNA干扰序列设计原则设计RNA干扰靶点序列,构建质粒后转染大肠杆菌,筛选阳性菌并验证插入序列,慢病毒包装干扰片段后感染精母细胞,Real-time PCR检测下调Speedy A基因表达的有效干扰片段；Gateway技术构建包含有效干扰片段和四环素反应元件(TRE)的质粒,建立转基因小鼠并筛选到纯合子,然后与四环素调控的反式激活子(rtTA)转基因小鼠杂交,筛选TRE和rtTA双阳性的小鼠,喂食强力霉素(Dox)诱导小鼠体内RNA干扰片段的表达,下调Speedy A基因的表达水平,建立可控性Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,以Real-time PCR及Western Blot分别检测模型组小鼠与对照组小鼠在mRNA水平以及蛋白水平Speedy A基因的表达差异；HE染色初步观察睾丸组织形态学变化,TUNEL法检测小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况。结果实验设计了4个RNA干扰靶点序列,通过体外实验筛选下调Speedy A基因表达的有效干扰片段,Real-time PCR检测到精母细胞中最佳干扰片段对Speedy A基因表达的敲减程度达75%(P0.01),为有效靶点；成功构建了PDOWN-shSpdya入门克隆及pRP.EX2d-TREshSpdya表达克隆；成功建立了四环素诱导的Speedy A-RNA干扰转基因小鼠模型,诱导RNA干扰片段表达后,实时荧光定量PCR及Western Blot结果显示模型组小鼠与对照组小鼠相比S peedy A基因的表达量明显下降；HE染色及TUNEL法检测到模型组小鼠睾丸组织的精母细胞发生大量凋亡。结论本实验成功建立了基于Tet-On系统诱导表达的可控性Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,说明可以基于Tet-On系统活体研究精子发生相关基因的功能；初步分析发现Speedy A基因表达下调使生精细胞发生异常凋亡。模型的成功建立为进一步系统分析Speedy A基因在雄性生殖系统中的功能及其作用机制打下了基础。
【关键词】：TET-ON系统 Speedy A基因 RNA干扰 精子发生 不育症
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R698.2;R-332
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 前言7-11
• 1. 男性不育与精子发生7
• 2. Tet-on系统调控的RNA干扰技术在精子发生研究中的应用7-9
• 3. Speedy A基因简介9-11
• 第一节 Speedy A基因RNA干扰序列设计及慢病毒载体制备11-23
• 材料和方法13-18
• 实验结果18-23
• 第二节 RNA干扰序列病毒包装与滴度测定23-30
• 材料和方法24-29
• 实验结果29-30
• 第三节 RNA干扰有效靶点筛选30-35
• 材料和方法30-32
• 实验结果32-35
• 第四节 基于Tet-on系统的RNA干扰载体的构建及可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的建立35-45
• 材料和方法35-42
• 实验结果42-45
• 第五节 可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的初步分析45-49
• 材料和方法45-48
• 实验结果48-49
• 讨论49-51
• 结论51-52
• 参考文献52-55
• 附录1：综述55-65
• 参考文献60-65
• 附录2：中英文缩略词表65-67
• 附录3：pRP.EX2d-TRE>shSpdya全序列67-69
• 附录4：个人简介69-70
• 致谢70-71

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本文编号：482176