MGMT基因在血小板特异性表达F9基因治疗血友病B中的应用研究

发布时间：2017-07-01 18:00

  本文关键词：MGMT基因在血小板特异性表达F9基因治疗血友病B中的应用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：在靶向血小板的血友病B基因治疗中,慢病毒体外转导的造血干细胞经骨髓移植进入受体小鼠体内。慢病毒转导还很难做到100%造血干细胞都有效转入了目的基因,同时在骨髓移植中,虽然受体小鼠经过辐照处理以清除自身的骨髓造血干细胞,但也不能保证100%的细胞清除率,而异体细胞与自身细胞相比总是会处于竞争的劣势。因此在治疗后小鼠体内只有一部分造血干细胞成功地表达了目的基因,这将影响目的基因的表达水平和长期表达稳定性。为提高目的基因的表达水平,帮助移植的细胞在受体内重建,本文研究内容为探索通过药物筛选基因MGMT(P140K)进行体内外药物筛选的方法进一步提高造血干细胞移植比例及FIX的表达水平。方法：我们从人肝细胞中克隆了MGMT基因,以定点突变的方法将MGMT第140位的脯氨酸(ccc)突变为赖氨酸(AAG)得到药物筛选基因MGMT(P140K),在2bF9-LV表达载体中插入药物筛选基因MGMT(P140K),构建成含有MGMT(P140K)基因的FIX病毒载体2bF9-LV(MGMT)。亚硝基类化疗药物卡氮芥(BCNU)和O6-BG合并处理造血干细胞,则只有转移并表达了MGMT(P140K)基因的细胞可以存活下来,其他细胞将被杀死。通过体外和体内实验,利用MGMT(P140K)、BCNU和06-BG就可以实现对转基因细胞的高效筛选。结果：成功构建了pWPT2bF9-MGMT (P140K)表达载体,并用这个载体制备了慢病毒载体2bF9-MGMT (P140K)-LV,同时也制备了一个GFP慢病毒载体GFP-LV,慢病毒的滴度达到109拷贝/ml,GFP-LV在293T细胞和Dami细胞中高表达。以2bF9-MGMT (P140K)-LV感染Dami细胞,2bF9可表达产生FIX,在此基础上进行药物筛选也初见成效。结论：我们以慢病毒包装体系成功地包装生产了两个病毒载体GFP-LV和2bF9-MGMT (P140K)-LV。通过GFP-LV在293T细胞和Dami细胞成功表达证明了慢病毒包装体系可生产质量可靠稳定的慢病毒。我们建立了针对MGMT的药物筛选体系,2bF9-MGMT (P140K)-LV感染细胞后可表达产生FIX,且针对MGMT的药物筛选实验证明了MGMT (P140K)的表达和功能；并通过病毒感染骨髓细胞,经过药物筛选在一定程度上体现出：体外药物筛选能够提高骨髓移植中转基因的效率。
【关键词】：基因治疗 血友病B 慢病毒 MGMT基因 药物筛选
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R554.1
【目录】：

• 致谢5-9
• 中文摘要9-10
• 英文摘要10-12
• 英文缩略词12-13
• 第一章 序言13-16
• 第二章 实验材料和方法16-38
• 2.1 主要实验试剂16-17
• 2.2 实验材料17
• 2.3 实验设备17-18
• 2.4 实验方法18-38
• 2.4.1 质粒构建18-27
• 2.4.1.1 野生型MGMT cDNA的克隆18-22
• 2.4.1.2 MGMT定点突变22-23
• 2.4.1.3 MGMT(P140K)与CMV启动子连接23-24
• 2.4.1.4 构建表达载体pWPT2bF9-MGMT24-27
• 2.4.2 细胞培养27-29
• 2.4.2.1 293T细胞培养27
• 2.4.2.2 Dami细胞培养27
• 2.4.2.3 小鼠造血干细胞的收集与培养27-29
• 2.4.3 慢病毒制备29-34
• 2.4.3.1 质粒宏量抽提29-30
• 2.4.3.2 磷酸钙法制备慢病毒30
• 2.4.3.3 慢病毒颗粒数测定30-32
• 2.4.3.4 慢病毒整合数测定32-34
• 2.4.4 慢病毒感染细胞实验34-35
• 2.4.4.1 感染293T细胞34
• 2.4.4.2 感染Dami细胞34-35
• 2.4.5 MGMT(P140K)功能测定实验35-36
• 2.4.5.1 不同浓度BCNU对细胞的杀伤作用36
• 2.4.5.2 MGMT(P140K)对细胞的保护作用36
• 2.4.6 FIX ELISA36-38
• 第三章 实验结果38-48
• 3.1 载体的构建与鉴定38-41
• 3.1.1 MGMT cDNA的克隆38
• 3.1.2 MGMT cDNA的定点突变38-39
• 3.1.3 MGMT(P140K)亚克隆至PCIneo39-40
• 3.1.4 CMV—MGMT(P140K)连接至pWPT2bF940-41
• 3.2 GFP—LV慢病毒制备与鉴定41-43
• 3.2.1 GFP慢病毒(GFP—LV)的制备41-42
• 3.2.2 GFP慢病毒(GFP—LV)的鉴定42-43
• 3.3 2bF9-MGMT(P140K)-LV制备与FIX的表达结果43-45
• 3.3.1 2bF9-MGMT(P140K)慢病毒的制备43
• 3.3.2 2bF9-MGMT(P140K)-LV可成功感染Dami细胞并表达FIX43-45
• 3.4 293T细胞药物筛选45-46
• 3.5 Dami细胞药物筛选条件的进一步探索46-47
• 3.6 MGMT(P140K)对小鼠骨髓造血干细胞的保护作用47-48
• 第四章 讨论与结论48-50
• 4.1 讨论48-49
• 4.2 结论49-50
• 参考文献50-52
• 附录 实验溶液的配置52-55
• 综述55-63
• 参考文献61-63

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本文编号：506859