鸭呼肠孤病毒基因Ⅰ型与Ⅱ型鉴别诊断RT-PCR方法的建立与应用

发布时间：2017-07-02 23:08

  本文关键词：鸭呼肠孤病毒基因Ⅰ型与Ⅱ型鉴别诊断RT-PCR方法的建立与应用

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【摘要】：临床发病鸭(Anas platyrhynchos domestica)群中存在两种基因型鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)的感染。为建立一种能鉴别诊断DRVⅠ型(classical DRV,C-DRV)与Ⅱ型(novel DRV,N-DRV)的一步法RT-PCR检测方法,本研究通过对Gen Bank已公布的现有C-DRV和N-DRV S1和S4基因片段序列进行比对分析,设计合成两对特异性引物,并对引物浓度、退火温度和循环次数等扩增条件进行优化,建立一种能鉴别诊断C-DRV和N-DRV的一步法RT-PCR检测方法。结果表明,一步法RT-PCR最佳的反应体系为:Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1μL,2×1 Step Buffer 12.5μL,RNA模板1.5μL,上下游引物(20μmol/L)各1μL,RNase Free d H_2O补足25μL;最佳反应条件:50℃反转录30 min;94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30个循环。该方法可从C-DRV和N-DRV基因组中扩增出大小分别为249和505 bp单一特异性片段,从两种病毒基因组混合物中可同时扩增出两条特异性片段,而对鸭源常见病毒及正常细胞基因组在同等条件下检测均为阴性;该方法具有较高的敏感性,其最低病毒检出量分别为0.47和0.62个半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50);对不同代次、不同时间提取的病毒RNA样品重复检验3次,结果均一致。对浙江省2011~2015年采集的239份疑似临床病料进行检测,C-DRV与N-DRV的阳性率分别为2.5%(6/239)和31.4%(75/239);通过对阳性病料P10和P18扩增序列的测序也证实检测结果的准确性。本研究建立的双重一步法RT-PCR可以有效区分两种基因型DRV,且临床样品检测表明N-DRV是浙江省流行的优势基因型。本研究为鉴别诊断CDRV与N-DRV提供了一个快速、灵敏性高及低成本的实验室诊断方法,该方法的建立可为DRV的分子流行病毒学调查提供有效的技术支持。
【作者单位】： 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所;
【关键词】： 鸭呼肠孤病毒(DRV) 多重一步法RT-PCR 基因型
【基金】：国家自然科学基金(No.31302124) 浙江省重点研发计划项目(No.2015C02G4010058)
【分类号】：S852.65
【正文快照】： 鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)可以引起的番鸭(Cairna moschata)、北京鸭(Anas platyrhynchusdomesticus)、半番鸭(Cairina×Anas)和鹅(Anser domes-tica)等水禽的急性传染病,1997以来在广东、广西、福建、浙江和江西等地流行广泛(吴宝成等,2001;Wang et al.,2013;Yun et a

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