过表达mitf基因腺相关病毒的构建与鉴定

发布时间：2017-07-05 00:01

  本文关键词：过表达mitf基因腺相关病毒的构建与鉴定

  更多相关文章： ITF 腺相关病毒 基因治疗

【摘要】：目的获得能够过表达小眼畸形相关转录因子(mitf)的重组腺相关病毒载体,用于mitf基因突变相关疾病的基因治疗。方法利用PCR扩增获得目的基因,构建携带目的基因mitf的重组腺相关病毒载体,利用人工脂质体法将p AAV-RC,p Helper,以及p AAV-GFP系列载体转染到HEK293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法进行重组腺相关病毒载体构建,利用柱纯化法纯化病毒载体,q PCR法测定重组腺相关病毒载体滴度,病毒载体感染HEK293细胞进行病毒有效性及安全性鉴定,real-time PCR与western blot法进行mitf表达的鉴定。结果 PCR扩增和测序结果一致证实成功获得目的基因并且成功构建mitf基因腺相关病毒载体,测得高水平病毒滴度1.0~*10~^12vg/ml,病毒载体感染HEK293细胞转染效率为86.3%,并未发现HEK293细胞死亡,Real-time PCR及Western blot检测构建Mitf基因转录m RNA与表达的蛋白与正常MITF一致。结论成功构建的携带mitf基因的重组腺相关病毒载体为未来进行mitf突变导致的遗传性疾病的基因治疗提供新思路。
【作者单位】： 福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科福建省耳鼻咽喉研究所;解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所聋病教育部重点实验室;
【关键词】： ITF 腺相关病毒 基因治疗
【基金】：国家863青年科学家项目(2014AA020510) 国家自然科学基金(面上项目81271082,青年基金81400472) 北京科技创新基地培育与发展专项(z151100001615050) 福建省科技厅重点项目(2014I0003) 中国科协创新驱动助力工程(2016CXQD01)
【分类号】：R450;R596.1
【正文快照】： 小眼畸形相关转录因子(MITF)位于小鼠6号染色体,人类染色体3p12.3 14.1位点,由Mitf基因编码的含有419个氨基酸,分子量大小约为46k Da,具有组织特异性的,含有碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(b HLH-Zip)的二聚体结构[1-3]。Mitf通过b HLH-Zip结构域识别位于靶基因启动子区上的E-bo

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1 张W，

本文编号：519750