鼠李糖乳杆菌肽聚糖对鸡外周血单核细胞抗菌肽基因表达的影响及其信号转导途径
本文关键词：鼠李糖乳杆菌肽聚糖对鸡外周血单核细胞抗菌肽基因表达的影响及其信号转导途径
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【摘要】：抗菌肽是生物体天然免疫的重要成分,它们不仅具有广谱抗菌作用,还可作为细胞间免疫效应分子通过多重机制发挥免疫调节功能和抗感染作用。防御素和Cathelicidins是动物体内发现的两个主要抗菌肽家族,在维持机体抗感染方面发挥重要作用。鼠李糖乳杆菌是一种肠道益生菌,从中提取的细胞壁肽聚糖在鼠李糖乳杆菌发挥免疫调节作用特别是促进抗菌肽表达方面起重要作用。然而有关肽聚糖促进抗菌肽的表达而提高机体天然免疫和获得性免疫应答能力的调控机制仍未完全阐明。因此,本试验研究不同剂量的鼠李糖乳杆菌肽聚糖对鸡外周血单核细胞中抗菌肽β-防御素9(β-defensin 9,AvBD9)和Cathelicidin-B1(Cath-B1)基因表达的影响,并确定其最佳刺激浓度。同时,采用荧光定量PCR的方法检测肽聚糖促进抗菌肽表达对可能相关受体基因表达的影响。此外,利用特异性抗Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)抗体封闭、特异性抑制剂抑制相关分子等方法进一步探讨鼠李糖乳杆菌肽聚糖调控AvBD9、Cath-B1基因表达的可能信号转导途径。试验结果如下:(1)不同浓度的鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖均能不同程度的促进鸡外周血单核细胞内AvBD9、Cath-B1基因的表达。且我们发现促进AvBD9基因表达的最佳刺激浓度为200μg/ml,促进Cath-B1基因表达的最佳浓度为150μg/ml。(2)200μg/ml鼠李糖乳杆菌肽聚糖可促进鸡外周血单核细胞TLR2以及NOD样受体1(NOD1)、NALP3的表达,且NOD1的表达量极显著高于对照组(P0.01)。(3)使用抗体封闭TLR2以及用抑制剂抑制NOD1后,与肽聚糖组相比,AvBD9和Cath-B1 mRNA的表达水平均显著下降。且用Western blot检测发现,TLR2抗体和NOD1抑制剂预处理后NF-κB p65、P38、JNK蛋白的磷酸化与非磷酸化的比值显著下降(P㩳0.05)。(4)使用NF-kB特异性抑制剂PDTC,JNK MAPK特异性抑制剂SP600125,p38 MAPK特异性抑制剂SB203580,ERK1/2 MAPK特异性抑制剂SCH772984预处理鸡外周血单核细胞后,PDTC、SB203580、SP600125均不同程度的降低鼠李糖乳杆菌肽聚糖诱导的AvBD9、Cath-B1基因的表达,且PDTC抑制AvBD9、Cath-B1基因表达的幅度显著高于SB203580、SP600125。而SCH772984预处理后,AvBD9、Cath-B1基因的表达量反而不同程度的上调了。综上所述,鼠李糖乳杆菌完整肽聚糖可促进鸡外周血单核细胞中AvBD9、Cath-B1基因的表达,且对于不同的基因肽聚糖的最佳刺激浓度不同。鼠李糖乳杆菌肽聚糖可促进细胞表面TLR2受体、胞内NOD1、NALP3受体基因的表达,这表明肽聚糖促进抗菌肽的表达可能是由TLR2或NOD1、NALP3介导。鼠李糖乳杆菌肽聚糖可通过TLR2或NOD1介导的NF-κB和MAPK信号途径上调鸡外周血单核细胞AvBD9、Cath-B1的表达而发挥益生作用,提高鸡抗感染天然免疫功能。
【关键词】：鼠李糖乳杆菌MLGA 完整肽聚糖 鸡外周血单核细胞 禽β-防御素9 Cathelicidin-B1 Toll样受体2 NOD样受体1 信号转导通路
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：
- 摘要8-10
- Abstract10-12
- 英文缩写表12-13
- 第一部分 文献综述13-24
- 1 抗菌肽的研究进展13-16
- 1.1 抗菌肽概述13
- 1.2 禽抗菌肽的分类及分布13-14
- 1.3 禽抗菌肽的功能14-16
- 2 益生菌与抗菌肽的关系16-19
- 2.1 益生菌的益生作用16-17
- 2.2 益生菌诱导抗菌肽的表达17
- 2.3 益生菌促进抗菌肽表达的菌种特异性17-18
- 2.4 益生菌的特定组分促进宿主抗菌肽的表达18-19
- 3 诱导抗菌肽表达的信号转导途径19-21
- 3.1 Toll-样受体介导的信号转导途径19-20
- 3.2 NOD样受体与抗菌肽表达20-21
- 4 本论文研究目的、研究意义、研究内容及技术路线21-24
- 4.1 研究目的、意义及内容21-23
- 4.2 技术路线23-24
- 第二部分 试验部分24-55
- 试验一 鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖对鸡外周血单核细胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表达的影响24-36
- 1 材料与方法25-31
- 1.1 试验材料25-27
- 1.1.1 试验菌株25
- 1.1.2 主要试验仪器设备25
- 1.1.3 主要试剂25-26
- 1.1.4 培养基26
- 1.1.5 试剂配制26-27
- 1.2 试验方法与步骤27-30
- 1.2.1 鼠李糖乳杆菌MLGA的培养27
- 1.2.2 鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖（whole peptidoglycan， WPG）的分离提取27
- 1.2.3 肽聚糖酶解产物的制备27-28
- 1.2.4 鸡外周血单核细胞的分离与培养28
- 1.2.5 鸡外周血单核细胞与鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖、肽聚糖酶解产物共培养及AvBD9、Cath-B1 mRNA表达的检测28
- 1.2.6 外周血单核细胞总RNA的提取28-29
- 1.2.7 细胞总RNA反转录29
- 1.2.8 实时荧光定量RT-PCR29-30
- 1.2.8.1 特异性引物和探针的设计及合成29-30
- 1.2.8.2 荧光定量PCR30
- 1.3 数据处理及统计分析30-31
- 2 结果与分析31-34
- 2.1 细胞总RNA的提取31
- 2.2 AvBD9、Cath-B1、TLR2、NOD1、NALP3基因的PCR结果31-32
- 2.3 不同浓度鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖及其酶解产物对鸡外周血单核细胞AvBD9 mRNA表达水平的影响32-33
- 2.4 不同浓度鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖及其酶解产物对Cath-B1基因表达的影响33-34
- 3 讨论34-35
- 4 小结35-36
- 试验二 鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖诱导鸡外周血单核细胞抗菌肽基因表达的信号转导途径36-55
- 1 材料与方法37-43
- 1.1 试验材料37-38
- 1.1.1 主要试验仪器设备37-38
- 1.1.2 主要试剂38
- 1.2 试验方法与步骤38-42
- 1.2.1 鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖与鸡外周血单核细胞共培养38-39
- 1.2.1.1 鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖对TLR2、NOD1、NALP3、AvBD9、Cath-B1 mRNA表达的影响38
- 1.2.1.2 特异性抗体封闭TLR2后，，鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖对鸡外周血单核细胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1、MyD88基因表达的影响38-39
- 1.2.1.3 特异性抑制剂抑制NOD1后鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖对鸡外周血单核细胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表达的影响39
- 1.2.1.4 刺激后细胞总RNA的提取39
- 1.2.1.5 总RNA反转录39
- 1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测AvBD9、Cath-B1、TLR2、MyD88、NOD1、NALP3基因表达水平39-40
- 1.2.2.1 特异性引物和探针的设计及合成39-40
- 1.2.2.2 实时荧光定量PCR40
- 1.2.3 TLR2、NOD1介导的外周血单核细胞信号通路的研究40-42
- 1.2.3.1 特异性抗体封闭TLR2后，Western Bolt检测鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖刺激鸡外周血单核细胞后对NF-κB和AP-1 通路中相关蛋白的影响40-41
- 1.2.3.2 特异性抑制剂抑制NOD1后，Western Bolt检测鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖刺激鸡外周血单核细胞后对NF-κB和AP-1 通路中相关蛋白的影响41
- 1.2.3.3 信号通路阻断实验41
- 1.2.3.4 蛋白质提取41
- 1.2.3.5 核蛋白质定量41-42
- 1.2.3.6 Wetern Bolt（WB）检测42
- 1.3 数据处理及统计分析42-43
- 2 结果与分析43-49
- 2.1 TLR2、NOD1、NALP3、MyD88基因PCR结果图43-44
- 2.2 鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖对鸡外周血单核细胞AvBD9、Cath-B1、TLR2、NOD1、NALP3 mRNA表达的影响44
- 2.3 特异性抗体封闭TLR2后鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖对鸡外周血单核细胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1、MyD88基因表达的影响44-46
- 2.4 特异性NOD1抑制剂处理鸡外周血单核细胞后鼠李糖乳杆菌MLGA细胞壁完整肽聚糖对其抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表达的影响46-48
- 2.5 特异性抑制剂阻断NF-κB和AP-1 信号通路后鼠李糖乳杆菌细胞壁完整肽聚糖对鸡外周血单核细胞抗菌肽AvBD9、Cath-B1基因表达的影响48-49
- 3 讨论49-54
- 4 小结54-55
- 全文总结55-56
- 参考文献56-65
- 致谢65
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