山羊痘病毒N1L基因缺失重组毒株的构建及其生物特性研究

发布时间：2017-07-06 06:05

  本文关键词：山羊痘病毒N1L基因缺失重组毒株的构建及其生物特性研究

  更多相关文章： 山羊痘病毒 同源重组 基因缺失 重组病毒

【摘要】：本研究以GTPV基因组为模板,以N1L基因侧翼序列为同源重组左右臂构建了表达绿色荧光蛋白及黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的转移载体质粒pLR-EGFP-gpt。将pLR-EGFP-gpt与GTPV共转染Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)并在细胞内发生同源重组,通过加压筛选纯化出缺失N1L基因的重组病毒GTPV△N1L。采用相同方法在pLR-EGFP-gpt中反向插入N1L基因表达盒构建了N1基因缺失后再拯救的重组转移载体pLR-EGFP-gpt-N1Lrev,并与GTPV共转染后筛选出恢复突变的重组病毒GTPV N1Lrev。遗传稳定性和生物学特性鉴定证实,GTPV △ N1L能在至少10代内稳定遗传,且在细胞病变和生长性能等方面与亲本毒株相比均未发生显著改变,但是相同毒价的GTPV △ N1L与亲本毒株在病毒拷贝数上相差30倍,初步证实缺失N1L基因并没有对病毒在培养细胞中复制产生太大影响,但是使病毒毒力有一定程度的降低,表明N1L可能为病毒毒力因子之一。扩增GTPV N1L全长基因,构建了N1L基因的真核表达质粒pcDNA-N1L并转染Hela细胞,经G418加压筛选,采用RT-PCR和Western-blotting分析鉴定,成功获得了3株稳定表达N1L基因的Hela多克隆细胞株。本研究为深入探讨N1蛋白的生物学活性及在GTPV致病过程中的作用,阐明GTPV的发病机理奠定基础。
【关键词】：山羊痘病毒 同源重组 基因缺失 重组病毒
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-6
• abstract6-10
• 引言10-12
• 第一章 文献综述12-30
• 1.1 羊痘病毒的研究概况12-17
• 1.1.1 病原的分类及形态特征12
• 1.1.2 地理分布12-13
• 1.1.3 宿主范围13-14
• 1.1.4 传播方式14-15
• 1.1.5 临床症状及发病机制15
• 1.1.6 CaPV的免疫应答15-16
• 1.1.7 CaPV的疫苗16-17
• 1.2 痘病毒宿主范围及毒力相关基因的研究概况17-29
• 1.2.1 痘病毒的基因组结构和宿主范围18-19
• 1.2.2 痘病毒毒力基因和宿主范围基因19-28
• 1.2.3 痘病毒N1L基因研究概况28-29
• 1.3 本研究的目的与意义29-30
• 第二章 山羊痘病毒N1L基因缺失重组毒株的构建及其生物特性研究30-55
• 2.1 材料和方法30-43
• 2.1.1 材料30-32
• 2.1.2 方法32-34
• 2.1.3 转移载体质粒pLR-EGFP-gpt和pLR-EGFP-gpt-N1Lrev的构建及鉴定34-39
• 2.1.4 重组转移质粒转染条件的优化39
• 2.1.5 重组病毒GTPV△N1L和GTPV N1Lrev的制备、筛选和纯化39-40
• 2.1.6 GTPV P32荧光定量PCR检测方法40-42
• 2.1.7 重组病毒的生物学特性鉴定42-43
• 2.2 结果43-51
• 2.2.1 同源重组臂基因片段的克隆结果43-44
• 2.2.2 重组转移载体质粒的构建鉴定结果44
• 2.2.3 重组质粒转染条件优化结果44
• 2.2.4 重组病毒GTPV△N1L和GTPV N1Lrev的制备、纯化及PCR鉴定结果44-46
• 2.2.5 GTPV P32 Taqman荧光定量PCR检测方法的建立46-48
• 2.2.6 重组病毒的生物学特性鉴定48-51
• 2.3 讨论51-55
• 2.3.1 基因缺失转移载体质粒的设计与构建51-52
• 2.3.2 优化共转染条件,提高重组效率52-53
• 2.3.3 重组病毒的筛选与鉴定53
• 2.3.4 缺失N1基因对病毒生长和致病性的影响53-55
• 第三章 稳定表达山羊痘病毒N1L基因的Hela细胞系筛选55-65
• 3.1 材料和方法55-60
• 3.1.1 材料55-56
• 3.1.2 方法56-60
• 3.2 结果60-62
• 3.2.1 真核表达质粒pcDNA-N1L酶切鉴定结果60
• 3.2.2 G418工作浓度和最佳转染条件的确定60
• 3.2.3 抗性Hela细胞株RT-PCR的检测60-62
• 3.2.4 抗性Hela细胞Westem-blot结果62
• 3.3 讨论62-65
• 3.3.1 瞬时转染与稳定转染的区别62-63
• 3.3.2 痘病毒N1蛋白的研究背景63-64
• 3.3.3 构建稳定表达GTPVN1蛋白的Hela细胞株64-65
• 第四章 结论65-66
• 参考文献66-79
• 致谢79-80
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文80

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