矮牵牛几个花型相关基因初步功能鉴定

发布时间：2017-07-08 01:07

  本文关键词：矮牵牛几个花型相关基因初步功能鉴定

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【摘要】：随着人们生活水平的不断提高,对精神生活的享受也越来越重视。赏花可以作为精神享受的活动之一,使得社会中对花卉的需求量将会越来越大,对花卉质量的要求也会越来越高。目前在关于花卉的研究中,有花香、花色、花期和花型四大方向。然而,在花型的相关研究中,由于突变体的数量及类型有限,所以对其认识也因此而受到限制。通过调控高等植物的近远轴面的极性可以调控花型。就目前的研究报道,控制高等植物远轴面极性的基因家族主要有KANADI、YABBY和ARF3/4等,控制植物近轴面极性的基因有PHANTASTICA、HD-ZIPIII和AS1/2等。在拟南芥中,HD-ZIPIII(Class III HD ZIP)基因首次在异位叶片及腋芽分生组织中发现。其基因家族成员都参与控制叶片细胞分化、单复叶演化以及花器官发育等过程。矮牵牛也是研究植物器官发育的重要模式植物之一,但对矮牵牛花型相关基因的研究报道还不多,从而这些基因对矮牵牛各器官发育的影响仍然未知。本研究拟通过VIGS技术初步探索几个花型相关基因在矮牵牛中的功能。本研究首先根据前期获得的目的基因PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1的全长序列设计引物,采用PCR技术成功克隆出目的基因片段,以PhCHS作为报告基因,pTRV2-PhCHS作为载体,成功构建重组载体pTRV2-PhCHS-PhCNX5、pTRV2-PhCHS-PhPHV1、pTRV2-PhCHS-PhKNX2和pTRV2-PhCHS-PhAS2,以pTRV2为载体,成功构建pTRV2-PhKAN1重组载体,再利用VIGS技术获得PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1沉默植株。最后通过对其进行表型观察,花和叶衰老情况的观察,显微观察等途径探索PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1沉默植株表型及细胞水平上的变化,并对矮牵牛PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1进行初步的功能分析。结果如下:(1)PhCNX5在矮牵牛中参与生长素的合成来影响花原基细胞的分化从而影响花型;与矮牵牛叶片衰老有关,叶片更快变黄衰老。(2)PhPHV1与花梗发育相关,沉默植株花梗长度显著增加。(3)PhKNX2参与控制矮牵牛花原基细胞分化从而影响花型。(4)PhAS2参与控制矮牵牛花原基和叶原基细胞分化从而影响花型叶型。(5)PhKAN1在矮牵牛中参与植物激素合成或运输以及花原基细胞分化从而影响花型。
【关键词】：矮牵牛 花型 株型 VIGS
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S681.9
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 前言11-22
• 1.1 叶片发育的演化进展11-12
• 1.2 花型相关基因研究进展12-20
• 1.2.1 花发育的ABC模型到A-E模型12-13
• 1.2.2 CNX基因研究进展13-16
• 1.2.3 HD-ZIPIII、AS2基因研究进展16-17
• 1.2.4 KAN基因研究进展17-18
• 1.2.5 KNX基因研究进展18-20
• 1.3 病毒诱导基因沉默研究进展20-21
• 1.3.1 VIGS的原理机制20
• 1.3.2 TRV-VIGS系统20-21
• 1.4 目的意义21-22
• 2 材料与方法22-36
• 2.1 实验材料22-25
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 病毒载体22-23
• 2.1.3 菌种23
• 2.1.4 主要试剂23
• 2.1.5 PCR引物23-24
• 2.1.6 主要仪器设备24-25
• 2.2 实验方法25-36
• 2.2.1 矮牵牛总RNA的提取25-26
• 2.2.1.1 实验器具的处理与药品配制25
• 2.2.1.2 RNA提取步骤25-26
• 2.2.2 cDNA的合成26-27
• 2.2.3 目的基因片段的克隆27-29
• 2.2.3.1 引物的设计27
• 2.2.3.2 引物工作液的稀释27
• 2.2.3.3 PCR扩增与检测27-28
• 2.2.3.4 PCR产物的回收28-29
• 2.2.4 载体质粒的提取29-30
• 2.2.5 构建重组载体30-32
• 2.2.5.1 目的片段与载体连接30-31
• 2.2.5.2 大肠杆菌DH5α 感受态的制备31
• 2.2.5.3 连接产物导入大肠杆菌31-32
• 2.2.5.4 阳性克隆的鉴定32
• 2.2.5.5 重组质粒的抽提32
• 2.2.6 重组载体导入农杆菌32-33
• 2.2.6.1 农杆菌感受态的制备32-33
• 2.2.6.2 重组质粒导入农杆菌33
• 2.2.7 农杆菌侵染矮牵牛植株33
• 2.2.7.1 侵染液的配制33
• 2.2.7.2 侵染方法33
• 2.2.8 表型观察及材料处理33-35
• 2.2.8.1 表型观察及拍照33-34
• 2.2.8.2 观察花、叶衰老情况34
• 2.2.8.3 台盼蓝染色观察34
• 2.2.8.4 显微镜观察34-35
• 2.2.8.5 扫描电镜观察35
• 2.2.9 实时荧光定量PCR35-36
• 2.2.9.1 荧光引物设计35
• 2.2.9.2 荧光定量PCR方法35-36
• 2.2.9.3 实验数据分析36
• 3 结果与分析36-48
• 3.1 PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1基因片段的克隆36-38
• 3.1.1 PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1特异片段序列的获得36-37
• 3.1.2 PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1目的片段的扩增37
• 3.1.3 pTRV2和pTRV2-PhCHS载体质粒的提取37-38
• 3.2 VIGS载体构建38-39
• 3.3 重组载体导入农杆菌39-40
• 3.4 VIGS沉默后表型观察40-48
• 3.4.1 PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1沉默对矮牵牛的影响40-44
• 3.4.1.1 PhCNX5沉默对花型的影响40-41
• 3.4.1.2 PhCNX5沉默对叶的影响41-42
• 3.4.1.3 PhCNX5沉默对整体植株的影响42-43
• 3.4.1.4 PhCNX5沉默对生长素相关基因的影响43-44
• 3.4.2 PhPHV1沉默对矮牵牛的影响44-45
• 3.4.3 PhKNX2沉默对矮牵牛的影响45-46
• 3.4.4 PhAS2沉默对矮牵牛的影响46-47
• 3.4.4.1 PhAS2沉默对花型的影响46-47
• 3.4.4.2 PhAS2沉默对叶的影响47
• 3.4.5 PhKAN1沉默对矮牵牛的影响47-48
• 3.4.5.1 PhKAN1沉默对花型的影响47-48
• 3.4.5.2 PhKAN1沉默对植株长势的影响48
• 4 讨论与结论48-53
• 4.1 讨论48-52
• 4.1.1 PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1沉默对植株各器官变化的影响48-51
• 4.1.2 PhCNX5、PhPHV1、PhKNX2、PhAS2和PhKAN1研究结果的新颖之处51
• 4.1.3 下阶段工作51-52
• 4.2 结论52-53
• 致谢53-54
• 参考文献54-61
• 附录61-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;Ectopic expression of soybean GmKNT1 in Arabidopsis results in altered leaf morphology and flower identity[J];遗传学报;2008年07期

2 丁伟乔;徐全乐;蒲帆;高清祥;王崇英;;Pttkn1基因异位表达对烟草叶片形态的影响[J];西北植物学报;2008年03期

3 黄亦工;魏娜;孙宜;;观赏植物花期催延技术的研究进展[J];宁夏农林科技;2006年03期

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本文编号：532472