虎纹蛙MHCⅠ类、Ⅱ类基因的克隆与多态性分析

发布时间：2017-07-08 17:21

  本文关键词：虎纹蛙MHCⅠ类、Ⅱ类基因的克隆与多态性分析

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【摘要】：MHC (Major histocompatibility complex)即主要组织相容性复合体,是脊椎动物中直接介导免疫反应的一类细胞表面蛋白。MHC基因即是编码这类蛋白的基因家族,许多的研究已经表明MHC基因家族是脊椎动物体内变异最大的功能基因之一,具有较高的其变异主要出现在抗原结合部位,因为该部位与动物抵抗病原体的能力以及对环境的适应性直接相关,所以很多研究集中分析这个变异最大的区域。对于MHC Ⅰ类、Ⅱ类基因来说,exon3与exon2分别编码其抗原结合部位,是变异最大的区域,了解该区域的变异特性能为进一步研究生态学中的适应性进化、性选择等问题提供便利。而目前两栖类MHC基因的结构特点和进化模式的研究非常有限,为了更加系统全面的了解两栖类MHC基因的多态性情况,本研究的目标是从虎纹蛙(Hoplobatrachus chinensis)中克隆MHC Ⅰ类exon3基因与Ⅱ类exon2基因,并分析其多态性的维持机制。本文首先通过设计通用引物成功的获得了MHC基因Ⅰ类exon3 126bp, MHC Ⅱ类exon2 132bp。我们通过常规PCR方法以及Genomic Walking的方法共获得虎纹蛙MHC Ⅰ类基因1020bp,Ⅱ类基因2020bp,其中包含了全部的外显子部分。通过设计虎纹蛙特异性引物分别扩增虎纹蛙MHC Ⅰ类exon3与Ⅱ类exon2。然后在碧莲、大若岩与下廖三个种群中检测虎纹蛙的MHC Ⅰ类、Ⅱ类基因的多态性。获得了如下的研究结果：1、在27个野生虎纹蛙个体中检测出Ⅰ类等位基因10条,而在一个个体中最多达到了7个,表明虎纹蛙MHC Ⅰ类基因最少具有4个基因座；II类等位基因检测到7条等位基因,在一个个体中最多达到3个等位基因,表明虎纹蛙MHC Ⅱ类基因最少有2个基因座。2、通过DNAsp软件计算出其I类基因的10条等位基因的核苷酸序列变异位点为27.3%；II类基因的7条等位基因的核苷酸序列变异位点为13%。3、通过MEGA6.0计算所得到等位基因的氨基酸距离以及核苷酸距离,结果得到MHCⅠ类与Ⅱ类的氨基酸距离均大于核苷酸距离,暗示其经历过正选择,4、利用MEGA与一些其他在线程序一共检测到Ⅰ类6个正选择位点,其中有3个位于假定的抗原结合区；Ⅱ类一共检测到5个正选择位点,其中有两个位于抗原结合区。所以,我们得出虎纹蛙的MHC基因受到的正选择作用可能与寄生虫调控的平衡选择有关。5、通过构建系统进化发育树以及GRAD在线检测,均未发现有重组现象以及跨物种多态性。本研究为以后虎纹蛙的后续研究提供了较好的理论基础和分子标记。1、可以作为一种与功能相关的分子标记来研究虎纹蛙的不同地理种群的地理变异,也可以将虎纹蛙和其它两栖类联系起来系统的阐释两栖类基因的进化模式。2、可以将该基因与虎纹蛙抵抗病原菌的能力联系起来,揭示虎纹蛙抗病的分子机制。3、可以用该基因与虎纹蛙的配偶选择联系起来,揭示虎纹蛙的配偶选择机制。
【关键词】：MHC基因 多态性 正选择 虎纹蛙
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q953
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文献综述10-22
• 1 MHC基因结构与功能10-11
• 1.1 MHC Ⅰ类基因的分布与结构10
• 1.2 MHC Ⅱ类基因的分布与结构10-11
• 2 两栖类MHC基因多态性研究进展11-13
• 2.1 两栖类MHC基因研究现状11-12
• 2.2 MHC Ⅰ类基因多态性研究进展12-13
• 2.3 MHC Ⅱ类基因多态性研究进展13
• 3 MHC多态性维持机制13-17
• 3.1 MHC多态性的产生14
• 3.1.1 基因突变14
• 3.1.2 基因重组14
• 3.2 MHC基因多态性的维持14-17
• 3.2.1 寄生虫的诱导15
• 3.2.2 性选择15-16
• 3.2.3 跨物种多态性16-17
• 4 两栖类MHC多态性研究的应用17-18
• 4.1 种群遗传多样性的分析应用17
• 4.2 抗病能力分析中应用17-18
• 5 虎纹蛙研究进展18-20
• 5.1 分类地位以及分布18
• 5.1.1 虎纹蛙的分类以及形态特征18
• 5.1.2 虎纹蛙资源现状18
• 5.2 虎纹蛙研究进展18-20
• 5.2.1 形态学研究19
• 5.2.2 生理生化研究19
• 5.2.3 分子遗传学研究19-20
• 6 本研究的意义和目的20-22
• 第二章 材料与方法22-36
• 1 实验材料22-23
• 1.1 样本的采集22
• 1.2 主要仪器和设备22-23
• 1.3 主要的实验试剂23
• 2 主要实验方法的步骤23-26
• 2.1 基于RNA水平的相关实验23-25
• 2.1.1 RNA的提取以及检测24
• 2.1.2 逆转录24-25
• 2.2 基于DNA水平的相关实验25
• 2.3 感受态细胞的制备25-26
• 3 引物的设计26-32
• 3.1 DNA水平上设计引物26-27
• 3.2 RNA水平上设计引物27
• 3.3 Genomic Walking引物设计27-28
• 3.4 虎纹蛙MHC特异性引物的设计28-32
• 4 虎纹蛙MHC Ⅰ类exon3的克隆32-33
• 4.1 SSCP过程32-33
• 4.2 PAGE割胶回收33
• 4.3 DNA条带的再次扩增与克隆33
• 5 虎纹蛙MHC Ⅱ类基因exon2的克隆33-34
• 6 数据分析34-36
• 6.1 等位基因的确定和序列的对比34
• 6.2 计算遗传距离多样性指标34-35
• 6.3 选择信号检测35
• 6.4 重组检测35-36
• 第三章 结果分析36-48
• 1 虎纹蛙MHC Ⅰ类结果分析36-43
• 1.1 从RNA上设计引物得到的结果36
• 1.2 通用引物扩增结果36-37
• 1.3 Genome walking扩增结果37
• 1.4 SSCP结果37
• 1.5 序列多态性分析37-38
• 1.6 核苷酸序列多态性分析38
• 1.7 氨基酸序列分析38-39
• 1.8 正选择位点的分析39-41
• 1.9 跨物种多态性分析41-43
• 1.10 重组检测43
• 2 虎纹蛙MHC Ⅱ类基因结果分析43-48
• 2.1 DNA上得到的结果43
• 2.1.1 通用引物扩增结果43
• 2.1.2 Genome walking扩增结果43
• 2.2 序列多态性分析43-44
• 2.3 核苷酸序列多态性44-45
• 2.4 选择信号的检测45-46
• 2.5 跨物种多态性分析46-47
• 2.6 重组检测47-48
• 第四章 讨论48-52
• 1 引物设计48
• 2 基因座位数目48-49
• 3 正选择49-50
• 4 跨物种多态性50-51
• 5 重组现象51-52
• 第五章 小结和展望52-53
• 1 小结52
• 2 展望52-53
• 参考文献53-65
• 攻读学位期间发表的研究论文65
• 攻读学位期间参加的科研项目65-66
• 致谢66-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈东海;邵晨;王宇;;虎纹蛙微卫星位点的跨种引物筛选[J];湖北第二师范学院学报;2011年02期

2 刘丽;刘楚吾;郭昱嵩;汤恩埔;彭向文;;基于RAPD的SCAR分子标记技术鉴定虎纹蛙及引进种[J];海洋湖沼通报;2008年02期

3 邵晨,施时迪,谢建芳;酸胁迫对虎纹蛙红细胞及血红蛋白的影响[J];农业环境科学学报;2005年01期

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本文编号：535566