水稻叶片早衰基因OsPLS2的图位克隆及其功能分析

发布时间：2017-07-15 07:00

  本文关键词：水稻叶片早衰基因OsPLS2的图位克隆及其功能分析

  更多相关文章： 水稻 OsPLS2 叶片早衰 活性氧 脱落酸 基因定位 基因功能

【摘要】：叶片衰老是叶片生长发育的最终阶段,同时也是植物适应环境的重要表现。水稻等主要粮食作物的功能叶片在灌浆结实期提前衰老,缩短了叶片的生理功能期和籽粒充实时间,减少了叶片中光合产物向籽粒的运输,最终导致结实率降低,空秕率增加,粮食产量减产及品质性状(垩白和整精米率等)变差等。因此,研究叶片衰老生理特征及分子机制,对于调控叶片衰老起始和进程,提高作物产量和营养品质具有重要意义。本课题组利用EMS诱变籼稻恢复系浙恢7954获得叶片早衰突变体ospls2 (Qryza sativa premature leaf senescence 2, ospls2)本研究从生理生化,组织细胞以及分子等角度对该突变体进行了系统研究。主要结果如下：1.突变体ospls2的主要农艺性状突变体ospls2叶片叶尖在分蘖期便开始出现锈色斑点,随后向叶基部蔓延,导致整张叶片呈棕褐色,最后枯死。与野生型相比,ospls2突变体的结实率、千粒重和每穗粒数都极显著下降,造成严重减产。2.突变体ospls2对外源H202和ABA的响应用80 mM H202和0.25μM ABA处理突变体ospls2和7954野生型幼苗的实验表明,突变体植株生长受到更严重的抑制。H202处理后,突变体比7954对照的株高极显著下降27.44%。处理后的突变体比其未处理ospls2株高和根长分别下降51.74%和51.26%。ABA处理后,突变体比7954对照的株高和根长分别极显著下降19.08%和20.08%。用高浓度150 mM H202和500 μM ABA处理突变体ospls2和7954成熟期离体叶片的研究表明,处理后离体叶片加速衰老,且突变体ospls2的叶片衰老更加明显。3.突变体ospls2叶片早衰相关的分子水平分析对成熟期突变体ospls2和7954野生型叶片中ABA合成和代谢相关基因的表达分析表明, ospls2叶片中ABA合成相关基因OsNCED1, OsNCED3, OsNCED4和OsNCED5的表达量都极显著高于7954野生型,且ABA分解相关基因ABAox2和ABAox3的表达量极显著低于7954野生型,导致ospls2叶片中内源ABA含量过高,加速叶片衰老,同时对外源ABA也更敏感。野生型7954和ospls2突变体植株成熟期剑叶中衰老相关基因的相对表达量分析表明,与野生型7954相比,ospls2突变体叶片中衰老相关基因SGR、Osh36、 OsI85、OsI57和调控ABA信号途径的OsNAP基因的表达量都显著增加,说明ospls2突变体植株内衰老相关基因的相对表达量已远高于野生型,叶片衰老进程更快,衰老生理生化反应更剧烈。4.OsPLS2定位及候选基因的确定和功能验证利用ospls2/02428的F2代群体作为定位群体,将OsPLS2定位在第3号染色体的RM15363和RM15361标记之间。通过对候选基因进行测序,发现在LOC_Os03g38990的ORF区域发生了一个碱基G突变成A,进而造成该基因成熟mRNA的剪切发生变化,氨基酸编码区发生移码突变。并由遗传互补实验证实了突变体ospls2早衰表型确实是由于基因OsPLS2突变引起。结合OsPLS2基因注释以及其氨基酸序列分析,初步认为OsPLS2蛋白属于UFP1类似蛋白。OsPLS2基因的亚细胞定位研究表明,该基因主要在细胞质内和质膜上表达,这与前人对UPF1的表达主要集中在细胞质内的结论相符,为后期深入研究该基因的功能提供了研究方向。
【关键词】：水稻 OsPLS2 叶片早衰 活性氧 脱落酸 基因定位 基因功能
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 1 文献综述13-28
• 1.1 植物衰老概述13-14
• 1.2 叶片衰老过程及假说14-18
• 1.2.1 叶片衰老过程14-16
• 1.2.1.1 衰老起始与糖诱导作用14-15
• 1.2.1.2 衰老衰退与物质降解15-16
• 1.2.2 植物衰老假说16-18
• 1.3 叶片衰老的生理生化特征18-20
• 1.3.1 叶绿素的降解和光合功能衰退18
• 1.3.2 蛋白质水解18-19
• 1.3.3 碳水化合物的变化19
• 1.3.4 ROS累积及其清除系统19-20
• 1.4 影响叶片衰老的因素20-26
• 1.4.1 影响叶片衰老的内因20-24
• 1.4.2 影响叶片衰老的外因24-26
• 1.5 本研究的目的意义26-28
• 2 实验材料与方法28-36
• 2.1 水稻材料28
• 2.2 组织化学染色28-29
• 2.3. 外源H_2O_2和ABA处理29
• 2.4 植物组织动态取样29-30
• 2.5 总RNA提取方法30
• 2.6 RNA的逆转录30
• 2.7 qRT-PCR方法30-31
• 2.8 SSR标记分析31-32
• 2.9 遗传图谱构建32
• 2.10 候选基因的确定与测序32
• 2.11 OsPLS2基因功能互补载体及亚细胞定位载体构建32-33
• 2.12 水稻遗传转化33-34
• 2.13 转基因植株表型鉴定及分子检测34
• 2.14 亚细胞定位34-35
• 2.15 OsPLS2蛋白氨基酸序列分析35-36
• 3 结果与分析36-52
• 3.1 ospls2的主要农艺性状36
• 3.2 ospls2的组织化学染色分析36-38
• 3.3 外源H_2O_2对突变体ospls2幼苗期生长发育及离体叶片的影响38-39
• 3.4 外源ABA对突变体ospls2幼苗期生长发育及离体叶片的影响39-42
• 3.5 遗传分析及候选基因测序及序列比对分析42-45
• 3.5.1 早衰突变体ospls2的遗传分析42-43
• 3.5.2 早衰突变基因OsPLS2的定位43-44
• 3.5.3 早衰突变基因OsPLS2的测序及序列对比分析44-45
• 3.6 转基因植株的表型分析及分子鉴定45-48
• 3.7 OsPLS2的时空表达模式48
• 3.8 OsPLS2的亚细胞定位48-49
• 3.9 OsPLS2蛋白的氨基酸序列分析49-50
• 3.10 衰老相关基因的表达分析50-52
• 4 讨论52-55
• 5 主要结论与展望55-57
• 参考文献57-69

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本文编号：542788