兴安落叶松几丁质酶基因的克隆及特性分析

发布时间：2017-07-15 16:28

  本文关键词：兴安落叶松几丁质酶基因的克隆及特性分析

  更多相关文章： 兴安落叶松 表达特性 几丁质酶基因 耐寒性 转基因拟南芥

【摘要】：兴安落叶松(Larix gmelinii)主要分布于我国东北地区,是森林生态系统中的优势树种,既能在高寒环境下生存,又能在复杂的逆境条件下正常生长,是研究植物抗逆基因的良好材料。几丁质酶是一种植物抗逆相关蛋白,特别是在植物抵御病害及低温的过程中发挥重要的作用,它具有热滞活性,能够降低冰点、抑制冰晶生长及重结晶,从而保护植物免受冻害。本研究以分析几丁质酶在兴安落叶松抵御低温中所发挥的作用,探讨其在提高转基因植物抗寒性中的可应用性为目的,通过RT-PCR技术克隆得到了一个兴安落叶松几丁质酶基因,命名为LgChi2。LgChi2 cDNA全长包含一个831bp的开放阅读框,编码276个氨基酸,蛋白分子量为28.4kDa,理论等电点为7.83,DNA全长为1395bp,包含两个内含子,三个外显子。系统进化分析显示,LgChi2与挪威云杉、花旗松、日本柳杉等植物的classIV几丁酶基因具有极高的同源性。利用基因枪法转化洋葱表皮细胞对LgChi蛋白的亚细胞定位进行分析的结果显示,LgChi::GFP融合蛋白定位于细胞边缘。表达特性分析结果显示,该基因主要表达在兴安落叶松的幼茎中,在4℃低温胁迫条件下,LgChi2的表达量明显增加,显示该基因为诱导型表达基因。同时,低温胁迫条件下兴安落叶松几丁质酶的活性呈先升高后下降的趋势,进一步显示几丁质酶基因在兴安落叶松抵御低温胁迫中发挥作用。为进一步分析该基因在植物适应低温胁迫中的应答机制,我们分别构建了真核的双元表达载体pBI101-LgChi和原核表达载体pET32a(+)-LgChi,并通过遗传转化的方法深入分析其在提高转基因生物抗寒性中的作用。结果表明,pET32a(+)-LgChi重组菌经SDS-PAGE电泳检测,观察到与预期大小一致的融合表达蛋白,同时,LgChi基因在大肠杆菌DE3中超表达,增强了细胞在低温胁迫下的生长速度。低温胁迫下,转LgChi基因拟南芥和野生型拟南芥的三种抗氧化物酶即过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)的活性均增加,但转基因拟南芥的增幅明显大于野生型拟南芥,显示该基因在提高转基因植物耐寒性中发挥重要作用。以上研究结果为进一步分析兴安落叶松几丁质酶基因的功能、表达调控机理及兴安落叶松的抗寒分子机制奠定了基础,同时也为利用兴安落叶松的几丁质酶基因进行农作物及林木的抗寒性遗传改良提供了有价值的候选基因。
【关键词】：兴安落叶松 表达特性 几丁质酶基因 耐寒性 转基因拟南芥
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S791.222;Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-20
• 1.1 兴安落叶松11-12
• 1.1.1 形态特征11
• 1.1.2 生长环境与分布范围11
• 1.1.3 研究现状11-12
• 1.2 几丁质酶12-17
• 1.2.1 几丁质酶参与植物体内的新陈代谢12-13
• 1.2.2 几丁质酶研究进展13-17
• 1.3 低温胁迫与植物耐寒机制17-18
• 1.3.1 低温对植物的伤害17
• 1.3.2 植物的抗冻性17-18
• 1.3.3 冷害机制与植物抗冻性的生理指标18
• 1.4 研究意义及技术路线18-20
• 1.4.1 研究意义18-19
• 1.4.2 技术路线19-20
• 第二章 几丁质酶基因cDNA全长克隆及生物信息学分析20-31
• 2.1 材料和方法20-23
• 2.1.1 植物材料及培养20
• 2.1.2 实验试剂及其配制20-21
• 2.1.3 利用RT-PCR技术克隆兴安落叶松LgChi基因片段21-23
• 2.1.4 兴安落叶松几丁质酶基因的生物信息学分析23
• 2.1.5 兴安落叶松几丁质酶的系统进化分析23
• 2.1.6 兴安落叶松几丁质酶基因DNA全长的克隆23
• 2.2 结果和分析23-29
• 2.2.1 LgChi2基因cDNA全长的克隆23-24
• 2.2.2 LgChi2基因DNA全长的克隆24
• 2.2.3 兴安落叶松几丁质酶基因LgChi1/2的序列分析24-26
• 2.2.4 兴安落叶松几丁质酶基因的生物信息学分析26-28
• 2.2.5 LgChi1/2系统进化分析28-29
• 2.3 讨论29-31
• 第三章 兴安落叶松几丁质酶基因的表达特性分析31-41
• 3.1 材料和方法31-35
• 3.1.1 半定量RT-PCR分析31
• 3.1.2 低温胁迫兴安落叶松几丁质酶活性测定31-32
• 3.1.3 兴安落叶松几丁质酶的亚细胞定位分析32-35
• 3.2 结果和分析35-39
• 3.2.1 LgChi表达特性分析35-36
• 3.2.2 低温处理对兴安落叶松几丁质酶活性影响36-37
• 3.2.3 兴安落叶松几丁质酶基因的亚细胞定位分析37-39
• 3.3 讨论39-41
• 第四章 兴安落叶松几丁质酶基因LgChi1/2的原核表达分析41-48
• 4.1 材料和方法41-44
• 4.1.1 菌种和质粒41
• 4.1.2 实验试剂及配制41-42
• 4.1.3 原核表达载体构建42-43
• 4.1.4 融合蛋白诱导表达43-44
• 4.1.5 低温胁迫转基因大肠杆菌44
• 4.2 结果和分析44-47
• 4.2.1 兴安落叶松几丁质酶基因LgChi1/2原核表达载体构建44-46
• 4.2.2 LgChi1和LgChi2融合蛋白的诱导46
• 4.2.3 LgChi基因表达影响大肠杆菌在低温胁迫下的存活率46-47
• 4.3 讨论47-48
• 第五章 兴安落叶松几丁质酶基因LgChi1/2在拟南芥中的异源表达48-61
• 5.1 材料和方法48-54
• 5.1.1 pBI101-LgChi重组表达载体的构建48-51
• 5.1.2 拟南芥的遗传转化、筛选、鉴定51-52
• 5.1.3 转基因拟南芥的表型分析及抗氧化物酶酶活性测定52-54
• 5.2 结果和分析54-59
• 5.2.1 pBI101-LgChi1/2重组表达载体的构建54-56
• 5.2.2 拟南芥的遗传转化、筛选、鉴定56-57
• 5.2.3 转基因拟南芥的表型分析和抗氧化物酶活性测定57-59
• 5.3 讨论59-61
• 第六章 结论61-62
• 参考文献62-68
• 致谢68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李峰;周广胜;曹铭昌;;兴安落叶松地理分布对气候变化响应的模拟[J];应用生态学报;2006年12期

2 王国林;;兴安落叶松叶芽开放期与大豆高产期的研究与应用[J];黑龙江科技信息;2013年06期

3 徐振邦,戴洪才,陈华,单建平,戴力民,邵春海,杨善勋;1989年大兴安岭图强林业局兴安落叶松结实状况[J];生态学杂志;1992年03期

4 许贵，白鸣祺，王芳;兴安落叶松裸根苗培育与气象因子的关系[J];气象;1995年03期

5 乔辰,弓彩霞;十八个产地兴安落叶松种皮微形态的研究[J];植物研究;1996年04期

6 班勇，徐化成;原始老龄林内兴安落叶松种子命运的试验研究[J];生态学报;1996年05期

7 刘军，吕金印，，李树蓉;兴安落叶松幼苗对~（32）P的吸收与累积研究[J];西北植物学报;1996年06期

8 邱扬,李湛东,徐化成;兴安落叶松种群的稳定性与火干扰关系的研究[J];植物研究;1997年04期

9 严善春;袁红娥;王琪;王艳军;;叶损伤诱导兴安落叶松针叶中10种酚酸的变化[J];应用生态学报;2010年04期

10 武雪冬;杜宝昌;王丽;陈霞;刘炳友;;兴安落叶松主要病虫害防治技术[J];中国西部科技;2011年31期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 卓丽环;王玲;;两种材色兴安落叶松种子生物学特性的比较研究[A];加入WTO和中国科技与可持续发展——挑战与机遇、责任和对策（下册）[C];2002年

2 马海波;魏江生;周梅;王林和;;兴安落叶松原始林胸径与边材面积的相关性分析[A];2007自然科学学术论文（土壤肥料与农业可持续发展）[C];2007年

3 张培杲;杨书文;鲍务立;;兴安落叶松种子区的初步区划[A];全国林木遗传育种第五次学术报告会论文汇编[C];1986年

4 吴克贤;李伟;楼玉海;;兴安落叶松结实规律及其影响因子[A];面向21世纪的中国林木遗传育种——中国林学会林木遗传育种第四届年会文集[C];1997年

5 ;兴安落叶松的无性繁殖[A];全国林木遗传育种第五次学术报告会论文汇编[C];1986年

6 董文华;;高寒地区兴安落叶松扦插育苗的试验研究[A];科技创新与经济结构调整——第七届内蒙古自治区自然科学学术年会优秀论文集[C];2012年

7 余利敏;林晓飞;张文波;;兴安落叶松几丁质酶基因的克隆及特性分析[A];2013全国植物生物学大会论文集[C];2013年

8 王玉华;刘涧樱;曹化荣;唐春生;高景文;;大兴安岭兴安落叶松的起源及生物特性[A];2003年内蒙古自治区自然科学学术年会优秀论文集[C];2003年

9 余涛;郝建玺;;兴安落叶松侧枝生长初步研究[A];2003年内蒙古自治区自然科学学术年会优秀论文集[C];2003年

10 许易琦;;兴安落叶松引种试验区内的地理变异规律及最佳种源选择[A];面向21世纪的中国林木遗传育种——中国林学会林木遗传育种第四届年会文集[C];1997年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 ;兴安落叶松人工开花技术研究成功[N];今日信息报;2004年

中国博士学位论文全文数据库 前7条

1 卓丽环;兴安落叶松种内红材型与变异类型-白材型的比较研究[D];东北林业大学;2002年

2 徐伟;兴安落叶松诱导抗虫性研究[D];东北林业大学;2006年

3 那冬晨;兴安落叶松地理种源遗传多样性与利用研究[D];东北林业大学;2005年

4 杨秀丽;大兴安岭兴安落叶松森林生态系统菌根及其真菌多样性研究[D];内蒙古农业大学;2010年

5 王天龙;兴安落叶松真空干燥脱脂过程中松节油迁移特性及机理的研究[D];北京林业大学;2006年

6 高涛;大气环流和海温变化对兴安落叶松生长的气候影响[D];内蒙古农业大学;2013年

7 张训亚;兴安落叶松木材性质的声—超声技术预测[D];中国林业科学研究院;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 杨柳;干旱对兴安落叶松水分参数的影响[D];东北林业大学;2015年

2 刘玉佳;模拟干旱与变暖对兴安落叶松径向生长的影响[D];东北林业大学;2015年

3 郭妍雪;人工兴安落叶松心边材的变异特征[D];东北林业大学;2015年

4 张朋磊;兴安落叶松对气候变化响应的时间稳定性分析[D];东北林业大学;2015年

5 张丽;兴安落叶松几丁质酶基因的克隆及特性分析[D];内蒙古大学;2016年

6 白学平;兴安落叶松径向生长对气候响应的滞后性研究[D];沈阳农业大学;2016年

7 乔明星;兴安落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特性分析[D];内蒙古农业大学;2016年

8 宋彩玲;内蒙古大兴安岭兴安落叶松光合生理生态特性研究[D];内蒙古农业大学;2009年

9 朱晓明;不同纬度兴安落叶松水分参数对比研究[D];东北林业大学;2008年

10 霍宏;气候暖化对兴安落叶松光合和生长影响的研究[D];东北林业大学;2007年

本文编号：544770