MiR-21靶向沉默HEPN1基因促进肝细胞肝癌增殖的相关研究

发布时间：2017-07-15 21:10

  本文关键词：MiR-21靶向沉默HEPN1基因促进肝细胞肝癌增殖的相关研究

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【摘要】：目的:探讨HEPN1(hepatocellular carcinoma,down-regulated 1)基因与miR-21的相互作用及其在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展中的作用机制。方法:(1)运用生物信息学工具预测,发现HEPN1基因与miR-21间潜在的靶向关系;(2)运用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)和Western blot技术检测72对HCC组织及其癌旁组织中HEPN1和miR-21的表达量,并分析二者表达量的相关性;(3)构建含有miR-21靶位点序列和不含靶位点序列的重组质粒(pGL3-HEPN1-WT,p GL3-HEPN1-MT),分别与0-100 nM不同浓度的miR-21 mimic共转染肝癌细胞系(HepG2,Hep3B),通过双荧光素酶报告基因检测,验证HEPN1与miR-21的靶向关系;(4)分别用不同浓度的miR-21 inhibitor(0-200 nM)转染肝癌细胞系(HepG2,Hep3B),检测miR-21和HEPN1表达量及细胞增殖水平的变化。miR-21 inhibitor与siRNA-HEPN1共转染肝癌细胞系,进一步验证HCC细胞增殖变化是否由HEPN1介导。结果:(1)生物信息学工具初步发现HEPN1基因与miR-21间存在潜在的靶向关系;(2)qPCR检测结果显示,HCC癌旁组织中HEPN1的表达量比肝癌组织高33.5倍(P0.001),肝癌旁组织中miR-21的表达量比肝癌组织低3.21倍(P0.001),二者的表达量呈显著负相关(R2=0.442,P0.0001)。HEPN1蛋白表达水平与qPCR检测mRNA结果一致;(3)双荧光素酶报告基因检测结果显示,在转染不同浓度的miR-21 mimic时,pGL3-HEPN1-WT重组质粒转染组的荧光素酶活性均显著低于pGL3-HEPN1-MT重组质粒转染组。随着mi R-21 mimic浓度的增加,两种重组质粒转染组的荧光酶活性虽然均出现了显著下降,并呈现出miR-21 mimic浓度依赖性,但通过斜率分析发现二者之间的荧光下降程度仍存在显著性差异(Slope difference0.001);(4)不同浓度miR-21 inhibitor转染两种肝癌细胞系后,miR-21表达量均显著降低(P0.05),而HEPN1在mRNA和蛋白水平均显著性升高(P0.05)。MTT检测结果显示,随着miR-21 inhibitor浓度不断增加,肝癌细胞增殖出现明显抑制,而这种抑制效应可被siRNA-HEPN1部分反转。结论:(1)HEPN1可能是mi R-21潜在的靶基因之一;(2)MiR-21可能通过沉默HEPN1,促进肝癌细胞的增殖,进而参与HCC的发生发展。
【关键词】：HEPN1基因 MiR-21 3'非翻译区 肝细胞肝癌
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 引言9-11
• 材料与方法11-25
• 结果25-30
• 讨论30-32
• 结论32-33
• 论文创新点33-34
• 问题与展望34-35
• 参考文献35-38
• 综述38-56
• 参考文献48-56
• 附录56-63
• 中英文对照缩略词表63-64
• 攻读硕士学位期间发表论文64-65
• 致谢65-66

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本文编号：545758