鲜切生菜中沙门氏菌的生长预测及渗透抗逆境应答基因rpoS对沙门氏菌的影响

发布时间：2017-07-16 20:08

  本文关键词：鲜切生菜中沙门氏菌的生长预测及渗透抗逆境应答基因rpoS对沙门氏菌的影响

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【摘要】：沙门氏菌是一种分布广泛的食源性致病菌,严重影响着人们的健康和国民经济的发展。为了控制其危害,本文选用已经全基因测序的模式菌株Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344,及本研究构建的rpoS基因缺失的SL1 344菌株SL1344/△rpoS,和分离自食品中的野生菌株LQG-1进行微生物应急生长调控的研究。首先对SL1344进行驯化,使其能够在只有葡萄糖能够提供碳源的BMM培养基中稳定生长；并将已驯化的SL1344菌株进行周期性高渗刺激,探究沙门氏菌延滞期的变化情况；接着以SL1344为原始菌株,采用λred同源重组技术构建逆境应答相关基因rpoS基因缺失的沙门氏菌菌株SL1344/△rpoS。同时,以并从生鲜猪肉中分离得到沙门氏菌野生菌株LQG-1为研究对象,对其进行鉴定,并将SL1344、SL1344/△rpoS及LQG-1的生长在逆境中进行比较,探究rpoS在渗透应答中在转录层面的调控方式和变化,说明在鲜肉与鲜切生菜交叉感染沙门氏菌后,rpoS对生长动力学参数的影响作用。为说明环境周期性变化对微生物适应力的影响,对SL1344进行研究。结果表明(1)经驯化的SL1344连续3～4次传代,当初始菌量相同时,其达到稳定期时菌量的数量级也相同,说明SL1344能够在只有葡萄糖提供碳源的BMM培养基中稳定生长；(2)已驯化好的菌株SL1344在NaCl浓度为3%、3.5%、4%和5%的BMM中培养,根据其延滞期初始下降幅度及生长周期长短的比较结果,确定适宜的NaCl的添加浓度为3.5%；(3)已驯化且未经渗透处理的SL1344在含3.5%NaCl、0%NaCl的BMM中周期性交替的培养,并观察其在BMM-NaCl中的生长情况,结果发现SL1344首次在BMM-NaCl中培养,即为第0次转移,其延滞期初始下降幅度最大,生长至稳定期所需时间最长。随着转移次数的增多,延滞期的初始下降幅度越来越小,到第4次转移时几乎为零。为研究逆境应答基因rpoS对实际食品中沙门氏菌生长的影响情况,通过λ red同源重组技术,构建SL1344/△rpoS;从实际食品生鲜猪肉中分离得到LQG-1,并对其进行鉴定。结果显示：(1)构建SL1344/ArpoS菌株过程中,用同一对引物鉴定,rpoS基因PCR扩增产物片段、替换后扩增片段及消除后扩增片段分别为1344bp、1432bp、500bp左右,证明rpoS基因缺失菌株SL1344/ArpoS构建成功； (2)对LQG-1进行鉴定,其菌体短杆状、无芽孢、革兰氏染色呈阴性,经16SrDNA序列进行分析,确定其为沙门氏菌。为探索rpoS基因与实际食品中沙门氏菌生长的影响,将SL1344、 SL1344/△rpoS和LQG-1分别接种于LB肉汤、含NaCl 3.5%的BMM以及鲜切生菜上,以Baranyi建立得到其一级模型,拟合得到其生长动力学相关参数,比较延滞期和最大比生长速率,可以得知：(1)LB液体培养基中,三菌株生长基本同步；(2)在含3.5%NaCl的BMM中,SL1344比SL1344/△rpoS更容易适应新环境； (3)在生菜上,LQG-1来源于食品,更易在实际食品中建立新的循环,适应新环境。SL1344菌株有小幅度的生长,SL1344/△rpoS几乎不生长,在一段时间后逐渐衰亡。
【关键词】：沙门氏菌 生长预测模型 高渗逆境 rpoS基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS255.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1. 文献综述10-18
• 1.1 立题背景10-16
• 1.1.1 预测微生物学11-13
• 1.1.2 水分活度13-14
• 1.1.3 sigma因子14-16
• 1.2 研究目标16
• 1.3 研究内容16-17
• 1.4 技术路线17-18
• 2. 材料与方法18-27
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 样品、菌株及质粒18
• 2.1.2 培养基18-19
• 2.1.3 试剂19
• 2.1.4 引物19-20
• 2.2 仪器设备20
• 2.3 方法20-27
• 2.3.1 周期性高渗透压刺激下沙门氏菌SL1344的生长测定20-22
• 2.3.2 沙门氏菌rpoS缺失菌株SL1344/ΔrpoS的构建22-25
• 2.3.3 野生沙门氏菌菌株LQG-1的筛选及鉴定25-26
• 2.3.4 不同环境下沙门氏菌SL1344、SL1344/ArpoS、LQG-1的生长测定26-27
• 3 结果与分析27-38
• 3.1 周期性高渗透压刺激下沙门氏菌SL1344的生长测定27-31
• 3.1.1 SL1344的驯化结果27-28
• 3.1.2 渗透压条件的确定28-29
• 3.1.3 生长数据的采集29-31
• 3.2 沙门氏菌rpoS缺失菌株SL1 344/ΔrpoS的构建31-34
• 3.2.1 目的基因rpoS的鉴定31-32
• 3.2.2 含rpoS同源臂的CmLr基因片段的扩增32-33
• 3.2.3 SL1 344/ArpoS：：CmLr菌株的鉴定33
• 3.2.4 沙门氏菌rpoS基因缺陷菌株的PCR鉴定33-34
• 3.3 沙门氏菌野生菌株LQG-1筛选鉴定结果34-36
• 3.3.1 革兰氏染色结果34-35
• 3.3.2 16SrDNA鉴定35
• 3.3.3 系统进化树35-36
• 3.4 不同环境下沙门氏菌SL1344、SL1344/ArpoS、LQG-1的生长比较36-38
• 3.4.1 营养富集条件下三菌株的生长比较结果36-37
• 3.4.2 高渗应激条件下SL1344与SL1 344/ΔrpoS的生长比较结果37-38
• 3.4.3 实际食品(鲜切生菜)中三菌株的生长比较结果38
• 4 讨论38-41
• 5 全文结论41-42
• 6 创新点与展望42-44
• 6.1 创新点42
• 6.2 展望42-44
• 参考文献44-49
• 附录49-51
• 致谢51-52
• 攻读学位期间发表的文章目录52

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1 刘密;鲜切生菜中沙门氏菌的生长预测及渗透抗逆境应答基因rpoS对沙门氏菌的影响[D];四川农业大学;2016年

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本文编号：550323