PCV2优势T、B细胞表位与截短cap基因串联的构建、原核表达及免疫原性研究

发布时间：2017-07-17 04:15

  本文关键词：PCV2优势T、B细胞表位与截短cap基因串联的构建、原核表达及免疫原性研究

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【摘要】：猪圆环病毒2型(PCV2)是目前全球养猪业具有重要经济意义的重要病毒性病原体之一,现将与其感染相关的疾病统称为猪圆环病毒相关病(PCVAD),其中危害最严重的是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)。PCV2主要侵害机体的免疫系统,造成严重的免疫抑制,从而容易发生其他致病性微生物的继发或混合感染,严重危害猪群健康。自2006年猪圆环病毒2型疫苗问世以来,疫苗的免疫接种成为防治猪圆环病毒病的主要手段。目前四种商品化疫苗已在世界范围内广泛使用,其中两种都是以PCV2 Cap蛋白作为免疫原,实验和现场研究已经清晰地表明PCV2疫苗具有降低病毒血症、消除PCVAD、增加生长性能等方面的功效,但是在免疫接种的猪群中仍然会发生PCVAD,这意味着现有商品化疫苗的免疫接种无法完全阻止PCV2感染或传播;此外,还有全病毒培养获得的病毒滴度低、灭活不彻底导致毒力返强、价格昂贵和保护率差等可能性。因此,开发新的安全有效的疫苗对控制PCV2感染是十分必要的。PCV2 ORF2编码的Cap蛋白是病毒主要的结构蛋白并且具有型特异性表位,一直以来也是PCV2重组疫苗的靶向物,但是针对其他因素对Cap蛋白免疫原性影响的研究却很少。因此,本研究致力于寻找一种能增强Cap蛋白免疫原性的方法以期提高Cap蛋白亚单位疫苗的免疫效果。为了在原核表达系统表达PCV2截短Cap蛋白与T、B细胞表位的串联重组蛋白,并评价其免疫原性,我们根据之前的报道分别筛选了Rep和Cap蛋白上的T、B细胞表位后送去合成基因,然后将截短cap基因和合成的表位基因依次插入到pET-32a载体,共获得三种重组质粒:pET-B-cap、pET-T-cap和pET-T-B-cap。依次PCR、双酶切和DNA测序鉴定,结果证明成功构建三种重组表达质粒,之后转化E.coli BL21(DE3)感受态,在IPTG诱导下表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析验证,大小分别约为49、46和54 kDa,主要以包涵体形式存在,并具有较好的反应原性。分别用获得的rB-Cap、rT-Cap和rT-B-Cap蛋白制备的疫苗免疫SPF级BALB/c小鼠,间接ELISA抗体检测结果显示以上疫苗都能激发较高水平的Cap蛋白抗体,其中以rT-B-Cap组的抗体水平最高,且显著高于r Cap和商品化全病毒灭活疫苗组,表明同时串联T、B优势抗原表位的Cap蛋白免疫原性得到提高。优势表位串联Cap蛋白较好的抗原性凸显了以Cap蛋白为基础的疫苗在防治PCV2病毒感染方面的显著效果,并且也可能提供了一种用于提高基于表位的疫苗抗原性的方法。
【关键词】：PCV2 Cap蛋白 表位 串联表达 免疫接种
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 本文常用缩写词中英文对照7-12
• 1 前言12-17
• 1.1 猪圆环病毒2型研究进展12-16
• 1.1.1 病原学12
• 1.1.2 培养特性12-13
• 1.1.3 病毒基因组13
• 1.1.4 编码的主要蛋白13-14
• 1.1.5 主要免疫优势表位14-15
• 1.1.6 防控措施15-16
• 1.2 本研究的目的和意义16-17
• 2 材料与方法17-33
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 质粒、菌株、毒株和血清17
• 2.1.2 主要试剂17
• 2.1.3 主要仪器17-18
• 2.1.4 本文主要试剂配制方法18-19
• 2.1.4.1 SDS-PAGE所用溶液的配制18
• 2.1.4.2 Western blot所用溶液的配制18-19
• 2.1.4.3 其它试剂的配制19
• 2.2 方法19-33
• 2.2.1 PCV2 cap基因与表位基因的克隆19-23
• 2.2.1.1 引物设计与合成19-20
• 2.2.1.2 表位基因的合成20-21
• 2.2.1.3 PCV2-LG株DNA的提取21-22
• 2.2.1.4 PCV2 cap基因和表位基因的扩增22
• 2.2.1.5 纯化回收目的基因片段22-23
• 2.2.2 表达载体的构建23-28
• 2.2.2.1 表达载体pET-cap的构建23-26
• 2.2.2.2 表达载体pET-B-cap、pET-T-cap和pET-T-B-cap的构建26-28
• 2.2.3 串联重组蛋白的诱导表达及检测28-29
• 2.2.3.1 重组蛋白的诱导表达28
• 2.2.3.2 重组蛋白表达条件的优化28-29
• 2.2.3.3 重组蛋白的Western blot检测29
• 2.2.4 重组蛋白的制备及内毒素去除处理29-31
• 2.2.4.1 重组蛋白的可溶性分析29-30
• 2.2.4.2 重组蛋白准备及内毒素去除30
• 2.2.4.3 去内毒素处理和复性后重组蛋白的SDS-PAGE检测30
• 2.2.4.4 处理后重组蛋白的Western blot检测30
• 2.2.4.5 重组蛋白浓度的测定30-31
• 2.2.5 疫苗的制备31
• 2.2.6 重组蛋白免疫原性研究31-32
• 2.2.6.1 实验动物分组31
• 2.2.6.2 免疫程序及收集血清31-32
• 2.2.7 常规ELISA方法操作流程32
• 2.2.8 间接ELISA检测鼠血清特异性抗体32-33
• 2.2.8.1 待检血清最佳稀释度的确定32
• 2.2.8.2 商品化ELISA试剂盒用法32
• 2.2.8.3 操作步骤32-33
• 2.2.8.4 注意事项33
• 3 结果与分析33-48
• 3.1 PCV2 cap基因的克隆33-34
• 3.2 重组表达质粒pET-cap的PCR及双酶切鉴定34-35
• 3.3 基因序列测定和分析35
• 3.4 表位基因的扩增35-36
• 3.5 三种串联重组表达质粒的PCR及双酶切鉴定36-37
• 3.6 基因序列测定和分析37
• 3.7 表达产物的鉴定37-43
• 3.7.1 串联重组蛋白的SDS-PAGE检测37-42
• 3.7.2 目的蛋白的Western blot检测42-43
• 3.8 疫苗的制备43-45
• 3.8.1 内毒素去除效果检测43
• 3.8.2 内毒素去除及复性处理后的目的蛋白SDS-PAGE检测43-44
• 3.8.3 内毒素去除及复性后的重组蛋白的Western blot检测44-45
• 3.8.4 复性后目的蛋白浓度测定45
• 3.9 间接ELISA检测小鼠免疫后血清抗体45-48
• 3.9.1 小鼠免疫血清最佳稀释度的确定45-46
• 3.9.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定46
• 3.9.3 鼠血清ELISA检测结果46-48
• 4 讨论与结论48-51
• 全文总结51-52
• 致谢52-53
• 参考文献53-59
• 附录A:PCV2 cap基因序列59-60
• 附录B:三段合成的表位基因序列60-61
• 附录C:硕士期间科研成果61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 董林;王艳萍;沈志强;柳增善;;猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性[J];中国兽医学报;2014年11期

2 田晓婷;李宝玉;柳纪省;;猪圆环病毒2型两种重组多表位蛋白免疫效果的评价[J];中国兽医科学;2012年10期

3 蒋伟;袁远华;廖晓鸿;苏丹萍;贺东生;;猪圆环病毒2型多抗原表位串联在大肠杆菌中表达与反应原性分析[J];中国预防兽医学报;2012年08期

4 徐志文;郭万柱;唐玉香;朱玲;陈燕凌;徐凯;梅淼;;PPV VP2基因与PCV2 ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性[J];中国兽医学报;2011年11期

5 杨晓农;郭万柱;徐志文;王新;殷华平;王小玉;龙虎;;ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响[J];中国兽医学报;2008年09期

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本文编号：551932