大兴安岭土壤木聚糖酶基因多样性分析及其基因克隆与表达

发布时间：2017-07-17 22:08

  本文关键词：大兴安岭土壤木聚糖酶基因多样性分析及其基因克隆与表达

  更多相关文章： 大兴安岭 木聚糖酶 基因组测序 群落多样性 基因克隆与表达

【摘要】：近年来,能源短缺和环境污染已经成为全球不容忽视的问题,开发和利用可再生资源是解决这些问题的最佳途径,而对木聚糖降解和利用是方法之一。木聚糖酶主要分为糖苷水解酶家族的GH10和GH11。目前,通过基因克隆、体外表达和蛋白纯化等方法进行的木聚糖酶相关研究已有很多,但这些研究主要集中于纯培养的微生物,而对土壤中大量未培养微生物的木聚糖酶基因相关研究还较少,本文对微生物木聚糖酶基因进行多样性分析、基因克隆和表达研究,并可能获得酶活较高的、可用于实践的目的基因,同时希望更加全面的认识木聚糖酶基因。大兴安岭森林区土壤表层土壤木质纤维素丰富、蕴含着大量产木聚糖降解酶的微生物。本文采集了该区域的森林表层土壤,利用高通量测序分别分析其中微生物种类和糖苷水解酶家族中GH10及GI11 1基因的多样性,对其中的一些可能为新木聚糖酶的基因进行了克隆和体外表达。研究的主要研究结果和结论如下：1、微生物种类多样性：16S rDNA测序得到的27273条序列中,蛋白菌门中的鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)种群属于第一优势菌,占全部的6.75%,其次是蛋白菌门中的产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)类群和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)类群的细菌,分别占全部的5.58%和4.3%。Alpha多样性指标中香农指数为7.002407,ACE指数为14704.052,Chaol指数为10049.676。2、木聚糖酶基因多样性：从土壤宏基因组DNA中扩增GH10和GH11家族的木聚糖酶基因片段中,获得1144个GH10木聚糖酶片段序列和2712个GH11木聚糖酶片段序列。序列比对分析表明GH10家族的最高相似性范围为35%-90%,构建的进化树分为8个分支,优势菌属为堆囊菌属(sorangium);GH11家族的最高相似性范围为48%-94%,构建的进化树分为11个分支,优势菌属为链霉菌属(Streptomyces)。3、基因克隆和表达：从环境样中利用反向PCR成功克隆出xynH6基因全长,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,结果发现木聚糖酶酶活为11 U/mL。以上结果表明,大兴安岭表层土壤中微生物种类多样性和木聚糖酶基因多样性较高,且其中一些木聚糖酶基因序列具有较高的新颖性；土壤中GH10木聚糖酶的基因多样性和新颖性要高于GH11。本研究为大兴安岭森林未培养微生物木聚糖酶基因的多样性和利用提供基础依据。
【关键词】：大兴安岭 木聚糖酶 基因组测序 群落多样性 基因克隆与表达
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S714.3
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 前言9-23
• 1.1 木聚糖概述9-10
• 1.2 木聚糖酶简介10-16
• 1.2.1 木聚糖酶的分类11-15
• 1.2.2 木聚糖酶催化作用15-16
• 1.3 木聚糖酶的分子结构区域16-17
• 1.4 木聚糖酶的来源17-18
• 1.5 木聚糖酶的酶活性18-19
• 1.6 木聚糖酶分子克隆及基因工程19-20
• 1.7 木聚糖酶的应用20-22
• 1.7.1 饲料工业中的应用20
• 1.7.2 造纸工业中的应用20-21
• 1.7.3 食品工业中的应用21
• 1.7.4 能源及环境保护方面的应用21-22
• 1.8 本研究的内容、目的和意义22-23
• 2 材料与方法23-33
• 2.1 实验材料及设备23-25
• 2.1.1 采样23
• 2.1.2 菌株和载体23
• 2.1.3 主要化学试剂23
• 2.1.4 主要试剂盒及工具酶23-24
• 2.1.5 主要仪器设备24
• 2.1.6 培养基24
• 2.1.7 实验试剂24-25
• 2.1.8 引物25
• 2.2 土壤微生物宏基因组DNA的提取和纯化25-26
• 2.3 16S rDNA测序及多样性分析26-27
• 2.4 GH10、GH11家族木聚糖酶基因片段的测序及系统发育分析27
• 2.4.1 基因片段的扩增、测序27
• 2.4.2 基因片段的序列分析27
• 2.4.3 GH10、GH11木聚糖酶基因系统发育分析27
• 2.5 GH10、11木聚糖酶的多样性分析27-28
• 2.6 GH10木聚糖酶基因xynH6的克隆28-30
• 2.6.1 目标基因序列的选择28
• 2.6.2 木聚糖酶全长序列的扩增28-30
• 2.7 xynH6木聚糖酶基因的转化与表达方法30-33
• 2.7.1 目的基因的扩增30
• 2.7.2 目的基因的连接转化与鉴定30-32
• 2.7.3 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达32
• 2.7.4 诱导表达蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析32
• 2.7.5 木聚糖酶酶活检测32-33
• 3 结果与分析33-52
• 3.1 土壤宏基因组DNA33
• 3.2 16S rDNA多样性33-39
• 3.2.1 原始数据去除嵌合体及靶区域外序列33-34
• 3.2.2 操作分类单元(OTU)分类34
• 3.2.3 属水平群落结构分析34-36
• 3.2.4 Alpha多样性分析36-39
• 3.3 GH10家族木聚糖酶基因多样性分析39-43
• 3.3.1 土壤中GH10木聚糖酶的序列分析39-40
• 3.3.2 大兴安岭土壤环境中GH10木聚糖酶基因片段的系统发育分析40-42
• 3.3.3 大兴安岭土壤环境中GH10木聚糖酶基因片段的丰度分析42-43
• 3.4 GH11家族木聚糖酶基因多样性分析43-49
• 3.4.1 土壤中GH11木聚糖酶的序列分析43-45
• 3.4.2 大兴安岭土壤环境中GH11木聚糖酶基因片段的系统发育分析45-48
• 3.4.3 大兴安岭土壤环境中GH11木聚糖酶基因片段的丰度分析48-49
• 3.5 木聚糖酶基因的异源表达49-52
• 3.5.1 木聚糖酶基因xynH6的扩增49-50
• 3.5.2 木聚糖酶基因xynH6的克隆50
• 3.5.3 木聚糖酶基因xynH6的诱导表达及其活性检测50-52
• 4 讨论与结论52-55
• 4.1 讨论52-53
• 4.1.1 土壤微生物种类多样性52
• 4.1.2 木聚糖酶基因来源多样性52-53
• 4.2 结论53-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-63
• 附录63-73
• 作者简介73

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