光敏色素基因在转基因玉米株系基因组的整合位点

发布时间：2017-07-26 15:40

  本文关键词：光敏色素基因在转基因玉米株系基因组的整合位点

  更多相关文章： 基因组 整合位点 玉米 光敏色素基因 转基因

【摘要】：外源基因或表达结构的插入位点及整合方式,不仅关系外源基因的表达,而且可能引起插入位点突变,影响内源基因表达,是转基因机理研究和安全性评价的重要内容。玉米基因组比拟南芥和水稻等模式植物更为复杂,而且存在大量的重复序列和转座序列。因此,在玉米转基因研究中,外源基因插入位点及整合方式的鉴定更为重要,也更为困难。本实验以农杆菌介导法转化玉米内源光敏色素基因Phy A1、PhyA2和PhyB1的6个不同世代株系和阳性株为材料,经特异PCR纯合性检验后,用高效热不对称交错式PCR扩增T-DNA整合位点的侧翼序列,分析T-DNA的玉米基因组中的整合规律,讨论其对表现型的影响。所得结果如下：1.用两套巢式物分别扩增相应的选择标记基因及其启动子序列片段,表达载体pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos和pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos分别转化的T7代株系全部为阳性植株,纯合率为100%。表达载体pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos转化的T6代株系大部分为阳性植株,纯合率为90%。表达载体pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos转化的T3代株系纯合率为40%。在表达载体pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos转化To代植株中,检测出2个独立的阳性植株,阳性率为5%。2.hiTAIL-PCR和基因组步移扩增及序列分析结果,pCAMBIA1390-Ubi-PhyAl-T-nos转化T7代株系、pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos转化T7代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos转化T6代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos转化T3代株系以及pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos转化T0代阳性株1和2的T-DNA整合位点,分别位于玉米基因组第1染色体第284557834与284557835碱基、第9染色体第61944355与61944356碱基、第1染色体第26981167与26981168碱基、第6染色体第96491356与96491357碱基、第3染色体第125567445与125567446碱基和第4染色体第98934902与98934903碱基之间。3.根据上述6个转基因株系或T0代阳性株的T-DNA整合位点,在玉米基因组序列数据库中搜索上下游10 kb以内的功能基因序列、重复序列和转座子序列。结果表明,pCAMBIA1390-Ubi-PhyAl-T-T-nos和pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos分别转化T7代株系,pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos转化T6代株系和pTF101.1一Ubi-PhyB1-T-nos转化T0代阳性株2的T-DNA整合位点,_上-下游10 kb范围未发现功能基因序列、重复序列和转座子序列。pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos转化T3代株系的T-DNA整合位点下游1050 bp有一编码WRKY40转录因子的基因,上游70 kb还有一个功能未知基因。pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos转化T0代阳性株1的T-DNA整合位点下游20 bp有一编码精氨酸tRNA的基因,上游200 bp还有一个基因功能未知基因。4.上述6个转基因株系和T0代阳性株T-DNA左右边界共12个整合位点,共有4种整合模式：(1) T-DNA整合的断裂点发生在边界序列内,整合进玉米基因组的T-DNA不附带表达载体骨架和填充序列。(2) T-DNA整合的断裂点发生在边界序列以外,整合进玉米基因组的T-DNA附带部分表达载体骨架序列。(3) T-DNA边界与玉米基因组序列之间填充进一段与表达载体和玉米基因组均不同源的序列。(4) T-DNA整合的断裂点发生在边界序列以内,造成T-DNA边界序列的缺失。此外,在这12个整合的T-DNA左右边界序列中,均发现不同程度的碱基替代和缺失突变。综上所述,T-DNA在玉米基因组的整合位点和模式是多种多样的,每一转化事件各不相同。对于T-DNA整合位点接近或重合于功能基因序列的情况,在转基因安全性评价中应专门进行基因表达检测。表达载体pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos和pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos分别转化的T7代株系出现的株高和穗位高等性状的改变,是由过量表达的内源基因ZmPhyA1和ZmPhyB1引起。
【关键词】：基因组 整合位点 玉米 光敏色素基因 转基因
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1. 文献综述11-19
• 1.1 T-DNA整合特点12-13
• 1.1.1 T-DNA修复模型12-13
• 1.1.2 T-DNA整合对受体基因组的影响13
• 1.2 T-DNA整合模式研究进展13-15
• 1.3 热不对称交错式PCR15-18
• 1.3.1 TAIL-PCR原理15-16
• 1.3.2 hiTAIL-PCR的优点16-17
• 1.3.3 基因组步移17-18
• 1.4 目的意义18-19
• 2. 材料和方法19-28
• 2.1 基因组DNA提取19
• 2.2 转基因株系的纯合性检测19-22
• 2.3 hiTAIL-PCR扩增22-24
• 2.3.1 引物设计22-23
• 2.3.2 hiTAIL-PCR第一轮扩增23
• 2.3.3 hiTAIL-PCR第二轮扩增23
• 2.3.4 hiTAIL-PCR第三轮扩增23-24
• 2.3.5 凝胶电泳分离24
• 2.4 特异片段的亚克隆及测序24-25
• 2.4.1 亚克隆载体连接24
• 2.4.2 感受态细胞制备24
• 2.4.3 感受态细胞的转化24-25
• 2.4.4 特异片段的亚克隆及测序25
• 2.5 基因组序列比对25-26
• 2.5.1 侧翼序列与表达载体比对25
• 2.5.2 侧翼序列与玉米基因组比对25-26
• 2.5.3 边界序列与填充序列分析26
• 2.6 基因组步移26-28
• 3. 结果与分析28-41
• 3.1 转基因株系的纯合性28-29
• 3.2 hiTAIL-PCR扩增的特异片段29-31
• 3.3 T-DNA整合位点31-37
• 3.3.1 pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos转化的T_7代株系31
• 3.3.2 pTF101.1-Ubi-PhyAl-T-nos转化的T_6代株系31-32
• 3.3.3 pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos转化的T_3代株系32-33
• 3.3.4 pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos转化的T_0代阳性株133-34
• 3.3.5 pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos转化的T_7代株系34-36
• 3.3.6 pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos转化的T_0代阳性株236-37
• 3.4 整合位点侧翼的玉米基因组序列37-39
• 3.5 边界序列在整合中的突变39-41
• 4. 讨论41-43
• 4.1 T-DNA整合模式41-42
• 4.2 T-DNA整合对受体基因的影响42-43
• 5. 参考文献43-48
• 致谢48-49
• 附录49-55
• 攻读学位期间发表的学术论文55

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴波,朱作言;转基因动物整合位点的研究进展[J];遗传;2003年01期

2 张俊;龚秀丽;郭歆冰;任兆瑞;;应用反向PCR克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点序列[J];生物技术通讯;2008年06期

3 孔庆然;武美玲;朱江;格日乐其木格;郇延军;尹智;牟彦双;刘忠华;;转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究[J];生物化学与生物物理进展;2009年12期

4 刘娣;李斌;张冬杰;;利用连接介导PCR检测外源基因整合位点体系的建立[J];东北农业大学学报;2013年12期

5 孙汉顺;马文丽;高静宇;孙立哲;郑文岭;;HIV整合位点的生物信息学分析[J];生物信息学;2010年03期

6 徐汉福;幸俊逸;王职峰;夏庆友;;外源piggyBac转座元件在转基因家蚕中的整合位点分析[J];蚕学通讯;2010年01期

7 李莉;李小平;任林柱;陈立梅;王铁东;张英;闫森;欧阳红生;逄大欣;;hiTAIL-PCR技术鉴定转基因猪整合位点的研究[J];中国兽医学报;2010年09期

8 谢俊;许淼;龚秀丽;曲立娟;颜景斌;黄英;;优化反向PCR法对hTF转基因小鼠整合位点旁侧序列分析[J];中国医药生物技术;2011年03期

9 王琳;饶贤才;胡福泉;陈志瑾;谭银玲;;铜绿假单胞菌噬菌体PaP3整合位点的鉴定[J];医学研究生学报;2006年05期

10 宋磊;姜彦竹;张雪洪;;在大肠杆菌和沙门氏菌中整合位点为tmRNA的串联基因岛的模式和整合的时序性[J];科学通报;2011年32期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 欧海龙;黄英;曾溢滔;;ΦC31整合酶介导的外源基因在牛基因组中整合位点的分析[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 苏锟楷;HIV-1整合酶S119D/E2C融合蛋白的定向整合及其整合位点的预测和分析[D];浙江大学;2011年

2 胡争;宫颈癌中高危型HPV整合位点的鉴定及机制研究[D];华中科技大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前7条

1 刘鑫;光敏色素基因在转基因玉米株系基因组的整合位点[D];四川农业大学;2016年

2 刘丹;转基因细胞及动物中外源基因拷贝数和整合位点研究[D];东北农业大学;2014年

3 丁东;MAPS：基因整合位点高通量测序分析的新方法[D];浙江大学;2011年

4 李斌;转MC4R基因拷贝数和整合位点的检测[D];东北农业大学;2014年

5 钱卫;慢病毒载体稳定转染人角质形成细胞克隆的整合位点倾向性分析及其体外生长特性研究[D];第三军医大学;2013年

6 丁冬林;染色体整合位点及组蛋白甲基化对HIV潜伏的影响[D];复旦大学;2011年

7 于超然;转fat-1基因牛外源基因整合位点鉴定[D];内蒙古大学;2014年

，

本文编号：577094