骨髓瘤细胞株H929的SOX2蛋白及趋化相关基因CCR1、CCR2、MCP-1等转录受白介素-1β预处理的骨髓间充质干细

发布时间：2017-07-30 14:22

  本文关键词：骨髓瘤细胞株H929的SOX2蛋白及趋化相关基因CCR1、CCR2、MCP-1等转录受白介素-1β预处理的骨髓间充质干细胞影响

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【摘要】：目的:观察白介素(interleukin,IL)-1β单次或多次预处理人BMMSCs后,对BMMSCs的BMP-2表达的影响;以及不同方案预处理的BMMSCs与MM细胞株共培养后,观察其对骨髓瘤细胞的干细胞相关蛋白、趋化细胞因子及其相关受体等表达的影响。方法:1、实验分三组:A组:为无IL-1β预处理的BMMSCs对照组、B组:为IL-1β预刺激1天、C组:IL-1β每天预刺激1次,共连续处理7天。三组分别加入骨髓瘤细胞株H929直接接触共培养,3天后收集各组中H929细胞。观察各组细胞形态及生长状况。2、采用细胞免疫组织化学染色法检测各组BMMSCs的BMP-2的表达,同时加用NF-k B的抑制剂(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC),研究NF-k B通路在BMMSCs的BMP-2表达的影响。3、采用Western blot方法检测各组H929细胞NANOG、SOX2和OCT-4蛋白的表达水平。4、采用RT-PCR方法检测各组H929细胞因子CCR1、CCR2、CCR6、CXCR4、MCP-1、MIP-1α和DKK1的表达水平。结果:1、倒置显微镜观察示:各组BMMSCs均能在体外贴壁生长。经IL-1β预处理1 d和7 d后的BMMSCs,其形态与对照组均无明显区别,均呈梭形。H929细胞呈悬浮生长,部分细胞可聚集成串珠样葡萄状。单独培养与共培养的BMMSCs、H929细胞,形态上无明显差别。2、细胞免疫组化结果显示:与组A组比较,B组、C组BMMSCs的BMP-2表达增高;用NF-k B的抑制剂PDTC预处理后,实验组B、C两组BMP-2表达水平明显降低。3、Western blot结果显示:与A组比较,H929细胞株和B组、C组共培养后,SOX2蛋白表达水平升高,且B组、C组SOX2蛋白表达水平的相对灰度值与A组间存在统计学差异(P0.05;n=5)。A、B、C三组间NANOG、OCT-4蛋白的表达均无统计学差异。4、RT-PCR结果显示:与A组、B组比较,H929细胞株和C组共培养后,CCR1、CCR2、MCP-1、MIP-1α基因的相对表达水平均增高,且其存在统计学差异(P0.05;n=6)。但三组间CCR6、CXCR4、DKK1基因的相对表达量无统计学差异。结论:我们的体外实验结果显示,IL-1β单次或多次刺激正常骨髓BMMSCs后,可增加BMMSCs的BMP-2表达,并且BMP-2表达的上调能被NF-k B的抑制剂PDTC抑制;预处理的BMMSCs在与骨髓瘤细胞的相互作用中,对骨髓瘤细胞的干细胞基因表达,细胞因子及其受体表达等均产生影响。这提示骨髓微环境中异常水平炎性因子,除了可直接作用于骨髓瘤细胞外,还可以通过调节BMMSCs的功能,在BMMSCs与骨髓瘤细胞相互作用后,间接参与骨髓瘤疾病的发生和发展;IL-1β其对骨髓瘤细胞的间接影响效果,与IL-1β作用BMMSCs的时间长短有关。
【关键词】：多发性骨髓瘤细胞 骨髓间充质干细胞 骨髓微环境 IL-1β 干细胞基因
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.3
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩写索引12-13
• 第一章 引言13-16
• 第二章 实验材料、方法和设计16-30
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 实验细胞16
• 2.1.2 主要实验试剂16-17
• 2.1.3 主要实验器材17-18
• 2.2 溶液的配制18-20
• 2.3 实验方法20-28
• 2.3.1 实验分组20
• 2.3.2 BMMSCs的体外分离和培养20-21
• 2.3.3 BMMSCs的传代培养21
• 2.3.4 BMMSCs的冻存21-22
• 2.3.5 BMMSCs的复苏22
• 2.3.6 免疫组化法细胞的准备22
• 2.3.7 H929细胞的复苏22-23
• 2.3.8 H929细胞的培养23
• 2.3.9 H929细胞的冻存23
• 2.3.10 BMMSCs与H929细胞共培养23
• 2.3.11 H929细胞总蛋白的提取23-24
• 2.3.12 蛋白印迹法24-25
• 2.3.13 BMMSCs免疫组化化学染色25-26
• 2.3.14 H929细胞总RNA提取26-27
• 2.3.15 RNA逆转录反应27
• 2.3.16 实验所用引物27-28
• 2.3.17 实时荧光定量PCR反应28
• 2.4 统计学处理28-29
• 2.5 实验设计方案29-30
• 第三章 实验结果30-37
• 3.1 BMMSCs及H929细胞形态学观察30-31
• 3.2 细胞免疫组化结果31-32
• 3.3 WESTERN BLOT结果32-33
• 3.4 RT-PCR检测结果33-37
• 3.4.1 RNA结果33
• 3.4.2 标准曲线的建立33-35
• 3.4.3 RT-PCR结果35-37
• 第四章 讨论37-43
• 第五章 结论43-44
• 参考文献44-52
• 致谢52-53
• 综述53-64
• 参考文献59-64
• 在读学位期间发表的论文64

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