苹果树腐烂病菌三个果胶酶基因的致病功能研究

发布时间：2017-07-31 15:20

  本文关键词：苹果树腐烂病菌三个果胶酶基因的致病功能研究

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【摘要】：苹果树腐烂病是由子囊菌门黑腐皮壳属真菌Valsa mali引起的一种严重的枝干皮层腐烂病害,在我国发病普遍,严重影响了苹果的产量和品质。由于病菌的致病机理尚不完全明确,给腐烂病的预防和治理带来了一定困难,探明苹果树腐烂病菌的致病机理,可为病害防治提供理论依据。苹果树腐烂病菌转录组结果分析表明有三个果胶酶基因在病菌侵染过程中上调表达倍数最高,分别为多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)基因Vmpg7、Vmpg8和果胶裂解酶(Pectate Lyase,PL)基因Vmpl4,明确这三个果胶酶基因在病菌致病过程中的作用,可进一步探究V.mali的致病机理。利用qRT-PCR检测这三个果胶酶基因在病菌侵染定殖过程中的表达水平及基因敲除后同家族内其它基因的表达水平。通过Double-joint PCR构建基因敲除载体并利用PEG介导的原生质体转化技术进行基因单敲除及双敲除,经PCR检测及Southern Blot验证确定基因敲除突变体,通过gap-repair技术对基因进行回复。将各突变体接种到PDA培养基上观察突变体的营养生长;通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法检测各突变体胞外果胶酶活力;离体接种富士苹果叶片及枝条检测基因对致病力的影响;接种到果胶培养基上,观察对果胶的利用。具体研究结果如下:1、与野生型菌株03-8菌丝相比,多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7、Vmpg8和果胶裂解酶基因Vmpl4在病菌侵染定殖过程中分别上调表达27.73倍、8.19倍、10.20倍。2、通过原生质体转化及验证,分别获得Vmpg7、Vmpg8和Vmpl4单敲除突变体各3个、1个、1个,Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体3个,并通过gap-repair技术获得Vmpg7、Vmpg8基因回复突变体各1个。3、观察各突变体在PDA培养基上的菌落形态及大小,发现Vmpg7、Vmpg8和Vmpl4不影响病菌的营养生长;与03-8相比,Vmpg8单敲除及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活力显著降低,分别降低44.40%和33.55%,Vmpg7、Vmpl4敲除突变体果胶酶活力与03-8差异不显著;致病力结果表明,△Vmpg7-249、△Vmpl4-50和△Vmpg7/Vmpg8-119在叶片和枝条上的致病力与03-8相比均显著降低,△Vmpg7-249在叶片和枝条上的致病力分别降低16.97%和8.70%,△Vmpl4-50在叶片和枝条上的致病力分别降低16.82%和18.59%,△Vmpg7/Vmpg8-119在叶片和枝条上的致病力分别降低13.12%和14.27%,△Vmpg8-82在叶片上致病力降低9.26%,而在枝条上与03-8差异不显著。Vmpg7、Vmpg8、Vmpl4和Vmpg7/Vmpg8敲除突变体在果胶培养基上的生长3 d的菌落大小均小于03-8,分别减小9.58%、14.01%、8.79%和10.42%。Vmpg7和Vmpg8的基因回复突变体致病力、胞外果胶酶活力及在果胶培养基上的生长速率均回复到03-8水平。4、Vmpg7/Vmpg8双敲除后PG家族内有3个基因显著上调表达,Vmpl4敲除后PL家族内有4个基因上调表达明显。综上所述,多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7、Vmpg8和果胶裂解酶基因Vmpl4通过降解果胶参与苹果树腐烂病菌V.mali的致病过程,目的基因敲除引起了同家族内其它基因的表达量变化,家族内其它基因可能在病菌致病过程中与其协同作用。
【关键词】：苹果树腐烂病菌 果胶酶 多聚半乳糖醛酸酶 果胶裂解酶 致病力
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.611.11
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文献综述13-20
• 1.1 苹果树腐烂病研究概况13-15
• 1.1.1 苹果树腐烂病发生及危害13
• 1.1.2 苹果树腐烂病的发病症状13-14
• 1.1.3 苹果树腐烂病病原菌14
• 1.1.4 苹果树腐烂病菌的致病机理14
• 1.1.5 苹果树腐烂病的防治14-15
• 1.2 植物病原真菌细胞壁降解酶的研究15-16
• 1.2.1 细胞壁降解酶的分类15
• 1.2.2 细胞壁降解酶在真菌致病过程中的作用15-16
• 1.3 果胶酶研究现状16-17
• 1.3.1 果胶酶分类16
• 1.3.2 果胶酶在致病过程中的作用16-17
• 1.4 多聚半乳糖醛酸酶研究现状17-18
• 1.4.1 多聚半乳糖醛酸酶作用方式17
• 1.4.2 真菌多聚半乳糖醛酸酶的序列特征17
• 1.4.3 真菌多聚半乳糖醛酸酶的表达调控17-18
• 1.4.4 多聚半乳糖醛酸酶基因在真菌中的研究18
• 1.5 果胶裂解酶研究现状18-19
• 1.5.1 果胶裂解酶作用方式18
• 1.5.2 果胶裂解酶的理化性质18
• 1.5.3 果胶裂解酶基因在细菌中的研究18-19
• 1.5.4 果胶裂解酶基因在真菌中的研究19
• 1.6 研究目的及意义19-20
• 第二章 基因在菌丝和互作过程中差异表达分析20-24
• 2.1 材料、仪器与试剂20
• 2.1.1 材料20
• 2.1.2 仪器20
• 2.1.3 试剂20
• 2.2 试验方法20-22
• 2.2.1 接种取样20
• 2.2.2 总RNA提取20-21
• 2.2.3 cDNA第一链合成21
• 2.2.4 q RT-PCR验证基因表达量21-22
• 2.3 结果与分析22
• 2.4 结论与讨论22-24
• 第三章 基因敲除与回复24-40
• 3.1 材料、仪器与试剂24-25
• 3.1.1 材料24
• 3.1.2 仪器24
• 3.1.3 试剂24-25
• 3.2 试验方法25-36
• 3.2.1 基因单敲除载体构建25-29
• 3.2.2 原生质体制备与转化29
• 3.2.3 潮霉素初筛29-30
• 3.2.4 转化子DNA快速提取30
• 3.2.5 转化子PCR检测30-31
• 3.2.6 阳性转化子Southern blot验证31-32
• 3.2.7 Vmpg7/Vmpg8基因双敲除32-33
• 3.2.8 基因敲除回复33-36
• 3.3 结果与分析36-38
• 3.3.1 基因单敲除片段扩增及载体构建36
• 3.3.2 基因单敲除突变体检测36-37
• 3.3.3 Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体检测37-38
• 3.3.4 Vmpg7、Vmpg8回复突变体检测38
• 3.4 结论与讨论38-40
• 第四章 突变体表型分析40-47
• 4.1 材料、仪器与试剂40
• 4.1.1 材料40
• 4.1.2 仪器40
• 4.1.3 试剂40
• 4.2 试验方法40-41
• 4.2.1 营养生长分析40
• 4.2.2 果胶酶活性测定40-41
• 4.2.3 致病力检测41
• 4.2.4 对果胶的利用41
• 4.2.5 数据分析41
• 4.3 结果与分析41-45
• 4.3.1 营养生长分析41-42
• 4.3.2 胞外果胶酶活力检测42-43
• 4.3.3 致病力检测43-44
• 4.3.4 对果胶的利用44-45
• 4.4 结论与讨论45-47
• 第五章 家族内基因表达水平分析47-50
• 5.1 材料、仪器与试剂47
• 5.1.1 材料47
• 5.1.2 仪器47
• 5.1.3 试剂47
• 5.2 试验方法47-48
• 5.2.1 接种取样47
• 5.2.2 RNA提取及c DNA合成47
• 5.2.3 q RT-PCR验证家族内其它基因的表达水平47-48
• 5.3 结果与分析48-49
• 5.4 结论与讨论49-50
• 第六章 全文结论50-51
• 参考文献51-57
• 附录57-62
• 致谢62-63
• 作者简介63

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