花绒寄甲methuselah-like基因的克隆和表达研究

发布时间：2017-08-03 19:31

  本文关键词：花绒寄甲methuselah-like基因的克隆和表达研究

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【摘要】：花绒寄甲Dastarcus helophoroides(Fairmaire)隶属于鞘翅目Coleoptera穴甲科Bothrideridae,是天牛类、吉丁类和象甲类等蛀干害虫的有效天敌昆虫;与其他昆虫相比,花绒寄甲成虫拥有较长的寿命,在实验室人工饲养条件下可存活8年以上。methuselah(mth)是一类重要的受体基因,与昆虫的寿命、生殖能力和抗逆能力相关,但仅存在于果蝇Drosophila;随后发现的大量mth同源基因mth-like广泛存在于各类昆虫,但到目前为止在花绒寄甲中还未见报道。本研究在对mth-like进行检索的基础上,采用RACE-PCR技术进行全长扩增,运用多种生物信息学工具对其进行分析,并采用RT-qPCR技术对其在转录水平的表达情况进行解析。主要结果如下:1.在对转录组数据库进行检索,获得6条相应mth-like序列片段的基础上,对序列进行3’和5’RACE扩增,最后得到6条mth-like全长序列。将序列分别命名为mth-like1、mth-like2-1、mth-like2-2、mth-like2-3、mth-like5-1和mth-like5-2,将对应的氨基酸序列分别命名为Mth-like1、Mth-like2-1、Mth-like2-2、Mth-like2-3、Mth-like5-1和Mth-like5-2。2.在线预测和多序列比对结果表明6条序列均具有保守的七次跨膜结构;系统进化分析表明,Mth-like1、Mth-like2-1、Mth-like2-2、Mth-like5-1和Mth-like5-2都与赤拟谷盗的进化关系最近,Mth-like2-3则与膜翅目昆虫最近。3.RT-qPCR分析表明,6条基因在各发育阶段和不同组织均有表达,但表达图谱呈现出较大差异性。6条基因的表达量在成虫衰老的过程中均呈规律性变化,除mth-like2-1后期(20-30个月)表达量显著低于正常水平外,其余基因的表达量要么恢复到了正常水平(mth-like2-2),要么升高到较高水平(mth-like1、mth-like2-3、mth-like5-1和mth-like5-2)。mth-like1、mth-like2-1、mth-like2-2、和mth-like2-3对氧化胁迫均有响应,并表现出时间效应,推测这些基因可能与花绒寄甲的抗氧化能力有关;mth-like2-1、mth-like2-2和mth-like2-3对高温胁迫有响应,推测这些基因可能与花绒寄甲的抗高温能力相关;在饥饿胁迫下,6条基因的表达量均呈规律性变化,推测这些基因可能都与成虫的抗饥饿能力相关。
【关键词】：花绒寄甲 mth-like基因 RACE-PCR扩增 RT-qPCR定量表达
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S763.306.4
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-19
• 1.1 花绒寄甲简介12-14
• 1.1.1 花绒寄甲生物学习性12
• 1.1.2 花绒寄甲人工繁育12-13
• 1.1.3 花绒寄甲对天牛的防治效果13
• 1.1.4 花绒寄甲衰老机制13-14
• 1.2 Mth/Mth-like受体家族14-17
• 1.2.1 mth/mth-like基因的发现14
• 1.2.2 Mth/Mth-like受体的结构14-15
• 1.2.3 Mth/Mth-like受体的配体和信号转导通路15-16
• 1.2.4 Mth/Mth-like受体的分布和生理功能16-17
• 1.3 研究内容和目的意义17-18
• 1.3.1 研究内容17
• 1.3.2 研究的目的意义17-18
• 1.4 技术路线18-19
• 第二章 花绒寄甲mth-like基因的检索和克隆19-26
• 2.1 材料和方法19-23
• 2.1.1 供试虫源19
• 2.1.2 主要试剂与仪器19
• 2.1.3 花绒寄甲mth-like基因的检索19-20
• 2.1.4 花绒寄甲成虫总RNA提取和质量检测20-21
• 2.1.5 花绒寄甲mth-like基因片段的全长扩增21-23
• 2.2 结果与分析23-24
• 2.2.1 花绒寄甲mth-like基因的检索结果23-24
• 2.2.2 花绒寄甲mth-like基因片段的扩增结果24
• 2.3 小结24-25
• 2.4 讨论25-26
• 第三章 花绒寄甲mth-like基因的生物信息学分析26-32
• 3.1 分析方法26
• 3.1.1 序列特征分析26
• 3.1.2 系统进化分析26
• 3.2 分析结果26-30
• 3.2.1 氨基酸序列特征分析26-28
• 3.2.2 系统发育分析28-30
• 3.3 小结30-31
• 3.4 讨论31-32
• 第四章 花绒寄甲mth-like基因的表达模式分析32-48
• 4.1 材料和方法32-36
• 4.1.1 供试虫源32
• 4.1.2 主要试剂与仪器32
• 4.1.3 不同发育阶段花绒寄甲的收集32
• 4.1.4 花绒寄甲成虫的解剖与组织的收集32-33
• 4.1.5 不同存活时间花绒寄甲成虫的收集33
• 4.1.6 氧化胁迫处理33
• 4.1.7 高温胁迫处理33
• 4.1.8 饥饿胁迫处理33-34
• 4.1.9 总RNA的提取和第一链c DNA的合成34
• 4.1.10 内参基因的选择和引物设计34-35
• 4.1.11 引物熔解曲线和扩增效率分析35
• 4.1.12 定量PCR（RT-q PCR）35
• 4.1.13 数据分析35-36
• 4.2 结果与分析36-44
• 4.2.1 扩增产物熔解曲线和引物扩增效率36
• 4.2.2 花绒寄甲不同发育阶段mth-like基因的表达36-38
• 4.2.3 花绒寄甲成虫不同组织mth-like基因的表达38-39
• 4.2.4 不同存活时间花绒寄甲成虫mth-like基因的表达39-40
• 4.2.5 氧化胁迫下花绒寄甲成虫mth-like基因的表达40-42
• 4.2.6 高温胁迫下花绒寄甲成虫mth-like基因的表达42-44
• 4.2.7 饥饿胁迫下花绒寄甲成虫mth-like基因的表达44
• 4.3 小结44-46
• 4.4 讨论46-48
• 第5章 主要结论、创新点和研究展望48-50
• 5.1 主要结论48-49
• 5.1.1 克隆获得6条mth-like全长序列48
• 5.1.2 解析了mth-like基因在不同虫态的表达模式48
• 5.1.3 解析了mth-like基因的组织分布模式48-49
• 5.1.4 明确了mth-like基因表达随成虫衰老的变化模式49
• 5.1.5 明确了mth-like基因表达对不同胁迫的响应模式49
• 5.2 创新点49
• 5.3 研究展望49-50
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 作者简介56

【参考文献】

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本文编号：615988