耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

发布时间：2016-07-01 01:01

  本文关键词：耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

中国油料作物学报

ChineseJournalofOilCropSciences35（6）：703－7112013，

doi：10．7505/j．issn．1007－9084．2013．06．014

耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮

微生物nifH基因多样性的影响

1，2

王丽娟，李

11

刚，赵建宁，红

2*1

雨，修伟明，王

11，31*

慧，章秋艳，杨殿林

（1．农业部环境保护科研监测所，农业部产地环境质量重点实验室/天津市农业环境与农产品安全重点实验室，天津300191；2．内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古呼和浩特，010022；3．山西农业大学生命科学学院，山西太谷，030801）

ALS）及相应非转基因亲本大豆（PAT1、ALS1）和当地摘要：通过大田试验，以两种耐除草剂转基因大豆（PAT、主栽大豆中黄13（CK）为材料，采用聚合酶链式反应－变性梯度凝胶电泳（PCＲ－DGGE）技术及扩增产物序列分析ALS与相应探讨耐除草剂转基因大豆种植对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响。结果表明，PAT、方法，

ALS1相比，ALS根际土壤固氮微生物亲本大豆PAT1、根际土壤固氮微生物群落组成相似度均在60%左右。PAT、nifH基因多样性指数（H）和均匀度指数（EH）与相应亲本大豆相比差异均不显著（p＞0．05）。测序结果表明，PAT、ALS与相应亲本大豆根际土壤中固氮微生物主要隶属于蓝藻门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌

－

门（Firmicutes）。不同处理下nifH基因与理化因子的典范对应分析结果表明，速效磷（AP）、硝态氮（NO3－N）对

ALS1相比，与PAT1、两种耐除草剂转基因大豆固氮微生物区系的影响达到显著水平（p＜0．05）。以上结论表明，对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响不显著。

关键词：PCＲ－DGGE；耐除草剂；转基因大豆；nifH基因；群落多样性中图分类号：S562．048

文献标识码：A

文章编号：1007－9084（2013）06－0703－09

Effectsofherbicidetoleranttransgenicsoybeansonthediversityofsoil

nitrogen－fixingbacterialnifHgenesinrhizosphere

2

WANGLi－juan1，，LIGang1，ZHAOJian－ning1，HONGYu2*，

3

XIUWei－ming1，WANGHui1，ZHANGQiu－yan1，，YANGDian－lin1*

（1．KeyLaboratoryofOriginalAgro－environmentQualityofMinistryofAgriculture/TianjinKeyLaboratoryofAgro－environmentandAgro－productSafety，Agro－Environmental

ProtectionInstitute，MinistryofAgriculture，Tianjin300191，China；

2．CollegeofLifeScienceandTechnology，InnerMongoliaNormalUniversity，Hohhot010022，China；

3．CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China）

Abstract：Basedonthepolymerasechainreaction－denaturinggradientgelelectrophoresis（PCＲ－DGGE）andsequenceanalysis，twoherbicidetolerantgeneticallymodifiedsoybeans（PAT，ALS）andthecorrespondingnon－transgenicsoybeans（PAT1，ALS1）andthelocalmainnon－transgenicsoybean（Zhonghuang13，CK）wereselectedtoinvestigatetheeffectsofherbicidetoleranttransgenicsoybeancultivationonnitrogen－fixingbacteriainrhizosphereunderfieldexperiment．Theresultsshowedthatthecommunitycompositionsimilarityofsoilnitrogen－fixingbacteriabetweentransgenicsoybean（PAT，ALS）andthecorrespondingnon－transgenicsoybean（PAT1，

01-11收稿日期：2013-基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08012－005）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金；农业部产地环境质量重

点实验室/天津市农业环境与农产品安全重点实验室开放基金项目资助

E－mail：hiimnu@163．com；Tel：作者简介：王丽娟（1987－），女，内蒙古包头人，硕士研究生，主要从事转基因植物生态环境安全研究，

18697102030

*通讯作者：红雨（1969－），E－mail：hongyu@imnu．edu．cn；Tel：0471－女，蒙古族，博士，教授，主要从事植物生态学、保护生物学研究，

4392450；

E－mail：yangdianlin@caas．cn，Tel：022－杨殿林（1965－），男，河北香河人，博士，研究员，主要从事生物多样性与生态安全研究，

23611820

ALS1）wasapproximately60%．Comparedtothecorrespondingnon－transgenicsoybeans（PAT1，ALS1），thediversityindex（H）andevennessindex（EH）ofnitrogen－fixingbacterialnifHgenesinrhizoshpereofherbicidetolerantgeneticallymodifiedsoybeans（PAT，ALS）bothshowednosignificantdifference（p＞0．05）．Thesequen-cingandphylogeneticanalysisindicatedthatnitrogen－fixingbacterialnifHgenesinrhizoshpereofherbicidetoler-antgeneticallymodifiedsoybeans（PAT，ALS）andthecorrespondingnon－transgenicsoybeans（PAT1，ALS1）mainlybelongedtocyanobacteria，ProteobacteriaandFirmicutes．Nitrogen－fixingmicrobialcommunitiesweresig-nificantly（p＜0．05）influencedbythelevelsoftheavailablephosphorus（AP）andnitratenitrogen（NO3－－N）whencanonicalcorrespondenceanalysiswasusedtoidentifyrelationshipbetweennifHgeneandsoilphysicochemi-calfactors．Thisresultindicatedthatherbicidetolerantgeneticallymodifiedsoybeanshadnosignificanteffectsonthediversityofsoilnitrogen－fixingbacterialnifHgenesinrhizosphere．

Keywords：PCＲ－DGGE；Herbicidetolerance；Transgenicsoybean；nifHgene；Communitydiversity根据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）

2011年全球转基因作物种植面积达1．6亿公报道，顷，较2010年增长8%，在转基因作物商业化种植

［1］的16年间，转基因作物种植面积增长了近94倍。自1994年美国孟山都公司第一代耐草甘磷转基因

在ＲoundupＲeady（ＲＲ）系列抗草甘膦除草剂的作物田中，由于大量使用草甘膦，有可能引起土壤微生

［13］

物群落和植物健康状况的改变。因此，原有耐草甘膦转基因大豆GTS40－3－2已停止生产和使用，

ALS）。市场推出了新型耐除草剂转基因大豆（PAT、

转基因大豆种植面积大豆被批准商业化生产以来，

2011年转基因大豆达到7540万公顷，逐年增加，占为种植面积最大全球转基因作物种植面积的47%，

的转基因作物。在转基因作物生产实践不断发展和完善的同时，其安全性问题也越来越引起人们的重视。在植物生长过程中，土壤微生物的生长、繁殖和种群动态变化与植物根部分泌物和腐殖质释放的各

［2］

转基因植物所携带种代谢产物和组分密切相关，

的耐除草剂、杀虫等外源基因的表达产物进入土壤

是否对土壤微生物产生影响，对科学评价转基因植物潜在的生态风险具有重要意义

［3，4］

因此，本试验以两种新型耐除草剂转基因大豆

（PAT、ALS）及相应非转基因亲本大豆（PAT1、ALS1）和当地主栽大豆中黄13为研究对象，采用PCＲ－DGGE技术及扩增产物序列分析方法研究转基因大豆种植对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性和群落结构的影响，为耐除草剂转基因大豆生物安全性评价提供理论支撑。

1

1．1

材料与方法

试验地概况

研究地点位于山东省农业科学研究院植物保护

。

氮素是农作物生长的必需元素，生物固氮在农

田生态系统中具有十分重要的作用。固氮微生物是土壤生态系统生物固氮的主要执行者，其与大豆形成的共生固氮关系可为农作物提供所需的氮营［5］

养。固氮微生物群落结构组成对土壤氮素固定及维持氮素循环平衡具有重要意义

［6］

研究所试验基地（36°42'59．32″N；117°05'06．41″E），属暖温带大陆性季风气候。年平均降雨量650～700mm，年平均气温14℃，平均有效积温4500℃。供试土壤为褐土，长期种植作物为普通大豆。

1．2试验材料

转基因大豆PAT及其亲本PAT1，转基因大豆ALS及其亲本ALS1，当地主栽大豆中黄13，均由山东省农科院植保所提供。其中，转基因大豆PAT是将Pat基因导入到常规大豆PAT1后获得的具有耐草铵膦铵盐除草剂特性的转基因材料；转基因大豆ALS是将gm－hra基因导入到常规大豆ALS1后获得具有耐乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂除草剂特性的转基因材料。中黄13为当地种植的一种普通非转基因大豆。

1．3试验设计与土壤样品采集

试验采用随机区组设计，每种大豆各3次重复，小区面积3m×20m。大豆于2011年5月23日种

。现已发现

所有固氮微生物中均含有编码铁蛋白的nifH基因，nifH基因的系统发育树与16SrＲNA具有高度的一致性

［7］

。基于nifH基因的分子生物学分析为固氮

微生物群落结构及多样性的探索提供了一种比传统培养更为灵敏和准确的分析方法。变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）则是一种被广泛使用的微生物群落多样性和组成分析

［8，9］

。国内外对于转基因大的分子生物学技术手段

［10～12］

。豆影响的研究多集中在耐草甘膦转基因大豆

但根据加拿大贸易与持续发展国际中心（IC－TSD）

的一份有关遗传修饰作物（GMC）的调查报告显示，

植，按行距20cm均匀撒播，大豆生长过程中不施用农药和化肥，其它按常规管理。2011年9月7日于大豆盛花期采集根际土壤样品，采集时选择长势一

每小区随机选取10株大豆。采用“抖落致的植株，

收集根际土，即将大豆植株连同根系从土壤法”

中挖出，将附着在根系的土壤抖落到塑料自封袋中。将10株大豆根际土壤混合均匀作为1个土壤样品。土壤样品置于低温冰盒中带回实验室，一部分－70℃保存用于土壤固氮微生物nifH基因多样性分析，一部分风干用于土壤理化性质测定。1．4

土壤理化性质测定

土壤有机质含量测定采用重铬酸钾容量法，土壤全氮测定采用凯氏定氮法，土壤硝态氮测定采用KCl浸提－紫外分光光度法，土壤铵态氮测定采用KCl浸提－靛酚蓝比色法，土壤全磷测定采用硫酸－高氯酸消煮法，土壤速效磷测定采用碳酸氢钠浸提－钼锑抗比色法

［15］［14］

1．5

土壤固氮微生物nifH基因多样性分析

1．5．1土壤样品DNA的提取称取0．50g保存于－70℃的土壤样品，用UltraCleanDNAIsolationKit（MoBioLaboratories，SolanaBeach，CA，USA）试剂按照最大得率方法提取土壤总DNA。土壤DNA盒，

经1．0%琼脂糖凝胶电泳检测样品质量。

1．5．2PCＲ扩增采用巢式PCＲ（nestedPCＲ）方

［16］

法扩增固氮微生物nifH基因序列，引物及反应条件见表1。第一轮PCＲ反应：25pmol每种引物，1．25U的ExTaq聚合酶（TaKaＲa），5μL10×Ex

400μmol·L－1dNTP（每种TaqBuffer（withMgCl2），

10μmol·L－1），100ng的模板DNA，终体积为50μL；1．25U的Ex第二轮PCＲ反应：25pmol每种引物，

Taq聚合酶（TaKaＲa），5μL10×ExTaqBuffer（with400μmol·L－1dNTP（每种10μmol·L－1），MgCl2），

以3μL第一轮PCＲ产物作为模板，终体积为50μL。

。

表1聚合酶链式反应中的引物及反应条件

Table1PrimersandPCＲconditions

引物序列5'－3'反应条件产物大小PrimersＲeactionconditionProductsize/bpSequences5'－3'

［17］

TACGGCAAＲGGTGGNATHG94℃5min；94℃1min，55℃1min，FGPH19

450第一轮反应Step1

ATSGCCATCATYTCＲCCGGA72℃1min，35个循环；72℃5minPolＲ

PolF－GC*TGCGAYCCSAAＲGCBGACTC95℃5min；94℃30sec，，48℃30sec，

320第二轮反应Step2

AQEＲGACGATGTAGATYTCCTG72℃30sec，35个循环；72℃5min

注：Note：Ｒ=A/G；N=A/G/C/T；H=T/C/A；Y=C/T；S=G/C．*GC夹子：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC

巢式PCＲNestedPCＲ

1．5．3变性梯度凝胶电泳采用Dcode通用突变

TM

典型菌株序列。用Mega5．0中的邻接法（Neighbor－Joining）建立固氮微生物nifH基因的系统发育树。1．7

数据分析

USA）对采用QuantityOne软件（Bio－Ｒad，DGGE图谱进行数字化处理。采用UPGMA法对DGGE图谱各样品的相似性进行聚类分析，并采用Shannon－Wiener指数（H）和均匀度（EH）来评价土壤固氮微生物nifH基因多样性。多样性指数和均匀度指数的计算公式如下：

H=－∑PilnPiEH=H/lnS

EH为均匀度指式中：H为Shannon－Wiener指数，

S为DGGE胶中条带数目，Pi为第i条带灰度占数，

该样品总灰度的比率。

采用SPSS16．0进行方差分析（ANOVA）、相关分析（CorrelationAnalysis），采用Canoco4．5软件包对环境因子与固氮细菌群落结构进行典范对应分析（CanonicalCorrespondenceAnalysis，CCA）。

检测系统（Bio－Ｒad，USA）进行DGGE分析。聚丙变性梯度为40%烯酰胺凝胶（37．5∶1）浓度为8%，

～60%，100%变性剂浓度为7mol/L尿素，40%（V/V）去离子甲酰胺。将20μLPCＲ产物和10μL6×loadingbuffer混匀后用微量进样器加入胶孔中。60℃、100V条件下电泳15h。电泳结束后用SYBＲTMGreen（1∶10000稀释）染色25min，然后于GelDoxXＲ凝胶成像系统（Bio－Ｒad，USA）进行观察与拍照。1．6

序列测定及比对分析

采用QuantityOne凝胶成像图像处理软件（Bio－Ｒad，USA）将DGGE图谱中条带的迁移位置进行根据其迁移率，在紫外灯下切取差异条数字化处理，

带。用不含GC夹的PolF和AQEＲ引物扩增。PCＲ产物纯化后与pGEMT－easyVector（Promega）连接，转化到感受态E．coliJM109中，挑取白色菌落。用菌落PCＲ方法检测阳性克隆

［18］

。阳性克隆送生工

生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结获取相近果与GenBank数据库进行序列比对分析，

2

2．1

结果与分析

耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物多样性的影响DGGE图谱分析

由图1可见（每种大豆各

不间多数为共性条带。UPGMA聚类分析结果表明，同耐除草剂转基因大豆分别分成两个簇，耐除草剂相似度转基因大豆PAT与其亲本PAT1聚到一起，为61%；耐除草剂转基因大豆ALS与其亲本ALS1聚到一起，相似度为59%。当地大豆中黄13与耐除草剂转基因大豆ALS聚成一簇，相似度为43%。以上结果表明，不同耐除草剂转基因大豆（PAT、ALS）根际土壤固氮微生物群落结构不同，耐除草剂ALS）与相应亲本（PAT1、ALS1）转基因大豆（PAT、

相比根际土壤固氮微生物群落结构无明显差异。

2．1．1

3次重复），各处理在低变性区表现出较好的相似性，高变性区有部分差异条带，但亮度较小。不同耐ALS）根际土壤固氮微生除草剂转基因大豆（PAT、

条带位置和亮物nifH基因的DGGE图谱的条带数、

度存在差异，但耐除草剂转基因大豆与相应亲本之

1－3代表CK，4－6代表PAT，7－9代表PAT1，10－12代表ALS，13－15代表ALS1注：每种处理各3次重复，

1－3：CK，4－6：PAT，7－9：PAT1，10－12：ALS，13－15：ALS1Note：Eachtreatmenthad3repeats，

Fig．1

图1土壤固氮微生物nifH基因PCＲ－DGGE电泳图谱（A）和聚类分析（B）

nifH/PCＲ－DGGEfingerprinting（A）andclusteranalysis（UPGMA）（B）ofsoilnitrogen－fixingmicroorganisms

根据DGGE图谱中每条条带的亮度，对不同耐除草剂转基因大豆根际土壤固氮微生物nifH基因Shannon－Wiener指数（H）和均匀度（EH）进行分析。从表2可见，根际土壤固氮微生物nifH基因多样性指数在1．05～1．45之间，均匀度在0．50左右，耐除草剂ALS）之间及转基因大豆与相应亲转基因大豆（PAT、

ALS1）之间均无显著差异（p＞0．05）。本（PAT1、

表2

不同处理土壤固氮菌DGGE图谱条带数、

多样性指数和均匀度指数

Table2NumberofDGGEbands，diversityindexandhomogeneousdegreesindexof

soilnitrogen－fixationbacteria

Shannon－Wiener均匀度指数条带数

BandnumberEH指数H

814121211

1．05±0．11b1．43±0．05a1．29±0．01ab1．40±0．04a1．25±0．04ab

0．50±0．05a0．54±0．02a0．52±0．01a0．56±0．01a0．52±0．02a

2．1．2构建

土壤固氮微生物nifH基因分析与系统发育

根据不同耐除草剂转基因大豆根际土壤固氮

微生物nifH基因DGGE图谱结果，选取主要条带割胶，共回收18条差异条带，对DGGE图谱切取的条带进行克隆测序，在NCBI中对序列进行比对分析。结果表明获得的条带序列隶属于3个门的10个属（表3），分别为蓝藻门（Cyanobacteria）的鱼腥藻属（Anabaena）和鞘丝藻属（Lyngbya）；变形菌门（Pro-teobacteria）α－变形菌纲（Alphaproteobacteria）的土壤杆菌属（Agrobacterium）、慢生根瘤菌属（Bradyrhi-zobium）、甲基孢囊菌属（Methylocystis），β－变形菌纲（Betaproteobacteria）的伯克氏菌目（Burkholderia-les），γ－变形菌纲（Gammaproteobacteria）的假单胞Azotobacter；厚壁菌门（Fir-菌目（Pseudomonadales）、

micutes）芽孢杆菌目（Bacillales）、Paenibacillaceae、Paenibacillus、梭菌属（Clostridium）。将获得的基因序列与GenBank其他相似序列进行系统发育分析并绘制系统发育图（图2）。

品种VarietiesCKPATPAT1ALSALS1

注：同列不同字母表示差异显著（p＜0．05）．n=3

Note：Differentletterswithinthesamelineindicatesignificantdiffer-enceatp＜0．05．n=3

Table3

表3DGGE条带比对结果及分布

ＲesultsofBLASTanalysisonthesequencesofthe18nifH/DGGEexcisedandsequencedbandsanddistribution

相似度Similarity/%

939199777691918088908283808092979292

CK√√√√√√√√

PAT√√√√√√√√√√

PAT1√√√√√√√√√√√

√√√√

√√√√

ALS√√√√√

ALS1√√√√√√

GenBank登录号及比对菌描述

GenBankaccessionNo．andDiscriptionofclosestrelatives

DQ294218．1AnabaenaazoticaEF634054．1Azotobacterchroococcum

EU693339．1Bacillussp．HQ335457UnculturedbacteriumCP003065．1ClostridiumclariflavumEF158805．1BurkholderiaxenovoransAB188122．1AzohydromonaslataCP002582．1ClostridiumlentocellumAF378719．1Methylocystissp．AB184931．1UnculturedbacteriumDQ776377．1UnculturedsoilbacteriumAF216932Unidentifiednitrogen－fixingbacteria

AF216932Bradyrhizobiumgenosp．HQ259566Bradyrhizobiumsp．DQ294216．1Anabaenasp．EF397815．1LyngbyawolleiCP000117．1AnabaenavariabilisU89346．1Anabaenavariabilis

条带编号BandNo．

123456789101112131415161718

√

图2

不同转基因大豆根际土壤nifH基因序列系统发育树（Neighbor－joining）Fig．2Neighbour－joiningtreedepictingthephylogeneticrelationships

amongnifHsequencesinrhizosphereoftransgenicsoybeans

耐除草剂转基因大豆ALS及其亲本ALS1的根际土壤中固氮微生物群落组成十分相似，在蓝藻门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌

门（Firmicutes）均有分布。其中蓝藻门（Cyanobacte-

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