农杆菌介导玉米愈伤遗传转化体系优化及基因工程雄性不育系初步研究

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农杆菌介导玉米愈伤遗传转化体系优化及基因工程雄性不育系初步研究

     论文目录

英文缩写与中英文扩展名第1-10页

中文摘要第10-12页

ABSTRACT第12-14页

第一部分 文献综述第14-45页

 1 玉米遗传转化研究综述第14-27页

   ·植物遗传转化的方法、原理及优缺点第14-19页

     ·基因枪转化法第14-15页

     ·农杆菌介导法第15-17页

     ·花粉管通道法第17-18页

     ·聚乙二醇介导法第18页

     ·电击法第18-19页

     ·脂质体介导法第19页

   ·农杆菌介导的玉米遗传转化的研究历程第19-22页

   ·影响玉米遗传转化的一些关键因素第22-27页

     ·玉米遗传转化中不同受体再生体系的建立第22-24页

       ·不同受体材料对玉米再生的影响第22-23页

       ·基因型对玉米体细胞再生能力的影响第23页

       ·培养条件对玉米体细胞再生能力的影响第23-24页

     ·受体材料、生长状况及基因型对遗传转化的影响第24页

     ·不同的培养基成分对玉米遗传转化的影响第24-26页

       ·基本培养基对玉米遗传转化的影响第24-25页

       ·培养基中附加其它物质对玉米遗传转化的影响第25-26页

     ·农杆菌菌株及载体对遗传转化的影响第26页

     ·选择性标记基因对遗传转化的影响第26-27页

     ·其它因素的影响第27页

 2 植物启动子研究概况第27-33页

   ·高等植物启动子的分类和结构第27-30页

     ·高等植物启动子的类别第27-29页

       ·组成型启动子第28页

       ·组织或器官特异性启动子第28页

       ·诱导型启动子第28-29页

     ·高等植物启动子的结构特征第29-30页

       ·转录起始位点第29页

       ·TATA-box第29-30页

       ·CAAT-box第30页

       ·G-box第30页

       ·增强子和沉默子第30页

   ·烟草中与花发育有关启动子的研究现状第30-32页

     ·烟草花药特异表达启动子第31页

     ·烟草花粉特异表达启动子第31-32页

   ·Zm13基因启动子的研究现状第32页

   ·启动子研究与作物雄性不育第32-33页

 3 基因工程创建雄性不育系研究概况第33-45页

   ·植物雄性不育(male sterility)的类型及遗传机制第33-36页

     ·细胞核不育型(GMS)第34页

       ·隐性核不育第34页

       ·显性核不育第34页

     ·细胞质雄性不育型(CMS)第34-36页

       ·孢子体细胞质雄性不育第35页

       ·配子体细胞质雄性不育第35-36页

   ·基因工程创建雄性不育系的研究进展第36-41页

     ·破坏花粉或花药的正常发育创造雄性不育性状第36-39页

       ·Mariani雄性不育系统(barnase／barstar—bar系统)第37-38页

       ·通过提早降解胼胝质获得植物雄性不育系第38-39页

       ·喷施外源物质诱导产生植物雄性不育第39页

       ·通过其它细胞毒素创建雄性不育第39页

     ·利用反义基因技术创造雄性不育性状第39-40页

     ·通过共抑制创造雄性不育第40-41页

     ·通过细菌影响小孢子发育引起雄性不育第41页

   ·argE基因及其应用研究进展第41-45页

第二部分 研究内容第45-113页

 第一章 农杆菌介导的玉米胚性愈伤的遗传转化研究第45-73页

  第一节 本研究的目的、意义及内容第45-46页

   1 本研究的背景、目的及意义第45-46页

   2 研究内容第46页

  第二节 材料与方法第46-54页

   1 实验材料第46-49页

   ·供试玉米材料第46页

   ·菌株及质粒第46-47页

   ·重要试剂、耗材及其它材料第47页

   ·各种培养基及成分第47-49页

     ·玉米培养基母液配方第47-48页

     ·玉米愈伤诱导及后期培养培养基成分第48页

     ·玉米愈伤侵染过程所用培养基成分第48-49页

   2 实验方法第49-54页

   ·农杆菌菌株的准备第49页

   ·玉米胚性愈伤的获得及农杆菌介导的遗传转化第49-51页

     ·玉米胚性愈伤的诱导及继代培养第49-50页

     ·农杆菌介导的遗传转化流程第50-51页

       ·农杆菌侵染液的准备第50页

       ·愈伤侵染第50页

       ·抗性愈伤的筛选及再生第50-51页

   ·玉米愈伤及转基因植株叶片的GUS表达分析第51-52页

     ·GUS染色液的配制第51-52页

     ·愈伤GUS瞬时表达率分析第52页

     ·转基因植株叶片GUS染色第52页

   ·玉米抗性愈伤率分析第52页

   ·转基因植株的分子检测第52-53页

     ·玉米叶片DNA微量提取法第52-53页

     ·抗性植株的PCR检测第53页

   ·玉米胚性愈伤对潮霉素抗性临界浓度的决定第53-54页

  第三节 结果与分析第54-66页

   1 玉米胚性愈伤对潮霉素抗性临界浓度的决定第54-55页

   2 不同菌株及愈伤材料对玉米愈伤遗传转化效率的影响第55-57页

   3 不同侵染时间对玉米愈伤遗传转化效率的影响第57-58页

   4 不同菌液(侵染液)浓度对玉米愈伤遗传转化效率的影响第58-59页

   5 侵染液中不同浓度Tween 20对玉米愈伤遗传转化效率的影响第59-60页

   6 不同共培养温度对玉米愈伤遗传转化效率的影响第60-61页

   7 不同共培养pH值对玉米愈伤遗传转化的影响第61-62页

   8 共培养基中不同浓度乙酰丁香酮对玉米愈伤遗传转化效率影响第62-63页

   9 共培养基中不同浓度L—半胱氨酸对玉米愈伤遗传转化效率的影响第63-64页

   10 共培养基中不同浓度二硫基苏糖醇对玉米愈伤遗传转化效率的影响第64-65页

   11 T_0代转基因植株的PCR检测及叶片的GUS表达分析第65-66页

  第四节 讨论第66-72页

   1 潮霉素筛选浓度对转基因愈伤存活率的影响第66页

   2 农杆菌菌株类型对遗传转化的影响第66-67页

   3 农杆菌的生长状态对遗传转化的影响第67-68页

   4 农杆菌侵染液浓度和侵染时间对愈伤转化的影响第68页

   5 共培养环境对遗传转化的影响第68-70页

   ·pH值第69页

   ·温度第69-70页

   6 表面活性剂和抗氧化剂在愈伤遗传转化中的作用第70-71页

   7 玉米遗传转化过程中阳性转化细胞和再生植株的一致性第71-72页

  第五节 小结第72-73页

 第二章 玉米花粉特异表达启动子Zm13的分离及功能鉴定、烟草花粉特异表达启动子序列NTPp13的分离、结构特征及时空表达分析第73-101页

  第一节 本研究背景、目的意义及技术路线第73-76页

   1 本研究背景第73-74页

   2 本研究目的及意义第74-75页

   ·对Zm13启动子活性检测第74页

   ·对野生型烟草中NTPp13序列的功能鉴定第74-75页

   3 本研究的技术路线第75-76页

  第二节 材料与方法第76-91页

   1 实验材料第76-77页

   ·植物材料第76页

   ·菌株及质粒第76页

   ·重要试剂、耗材及其它材料第76页

   ·培养基及成分第76-77页

   2 实验办法第77-91页

   ·玉米花粉特异表达启动子Zm13及烟草特异表达片段NTPp13的获得第77-78页

     ·玉米叶片和烟草叶片DNA微量提取法第77页

     ·玉米中Zm13启动子及烟草中NTPp13片段的PCR扩增第77-78页

   ·玉米启动子Zm13及烟草启动子片段NTPp13表达载体构建第78-83页

     ·PCR产物回收与纯化第78-79页

     ·目的片段与T载体连接第79页

     ·CaCl_2法制备大肠杆菌DH5α感受态第79-80页

     ·蓝白斑筛选平板的制备第80页

     ·热激转化法将质粒转入大肠杆菌第80页

     ·转化子的鉴定第80页

     ·细菌培养、收集以及碱裂解法提取质粒DNA第80-81页

     ·聚乙二醇法沉淀纯化质粒DNA第81-82页

     ·质粒及载体的酶切第82-83页

     ·Zm13及NTPp13片段与载体pBI121连接第83页

     ·热激法将质粒载体转入大肠杆菌DH5α感受态以及转化子的鉴定第83页

     ·三亲交配法将表达载体pBI121—Zm13(或NTPp13)导入农杆菌第83页

   ·农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草第83-84页

   ·转基因烟草继代及移栽第84页

   ·转Zm13启动子烟草植株的PCR检测及Zm13启动子活性鉴定第84-85页

     ·转Zm13启动子烟草叶片DNA微量提取法及GUS染色液的配制第84页

     ·转Zm13启动子抗性烟草植株的PCR检测第84-85页

     ·Zm13启动子的活性鉴定第85页

   ·转NTPp13-GUS烟草植株的分子检测第85-90页

     ·转NTPp13-GUS抗性烟草植株的PCR检测第85页

     ·转NTPp13-GUS烟草植株的PCR—Southern检测第85-90页

       ·探针DNA序列的获得第85页

       ·转基因烟草植株的PCR—Southern检测第85-90页

   ·NTPp13片段的启动子活性验证及时空特异表达第90-91页

     ·NTPp13片段在烟草花药中的活性验证第90页

     ·NTPp13片段的特异表达部位鉴定第90页

     ·不同花期NTPp13—GUS表达量分析第90-91页

     ·NTPp13片段启动子活性对温度影响的稳定性分析第91页

     ·GUS活性荧光定量方法第91页

  第三节 结果与分析第91-98页

   1 玉米花粉特异表达启动子Zm13的分离及活性鉴定第91-94页

   ·Zm13启动子的分离第91-92页

   ·Zm13启动子活性鉴定第92-94页

   2 烟草花粉特异表达序列NTPp13的结构和功能分析第94-98页

   ·NTPp13序列的结构分析第94-95页

   ·转NTPp13-GUS烟草植株的分子检测第95-96页

   ·NTPp13序列的启动子活性验证及时空特异表达第96-98页

   ·NTPp13启动子片段对温度改变的稳定性分析第98页

  第四节 讨论第98-100页

   1 玉米花粉特异表达启动子Zm13在创建雄性不育系中的应用第98-99页

   2 对NTPp13启动子序列的研究及意义第99-100页

  第五节 小结第100-101页

 第三章 基因工程创建玉米雄性不育系的初步研究第101-113页

  第一节 本研究目的、意义及技术路线第101页

   1 本研究目的及意义第101页

   2 本研究的技术路线第101页

  第二节 材料与方法第101-107页

   1 实验材料第101-104页

   ·植物材料第101-102页

   ·菌株及质粒第102页

   ·重要试剂、耗材及其它材料第102页

   ·培养基及成分第102-104页

   2 实验方法第104-107页

   ·脱乙酰酶基因argE的获得第104-105页

     ·大肠杆菌菌株基因组的提取第104页

     ·argE基因的获得第104-105页

   ·玉米花粉特异表达启动子Zm13的获得第105页

   ·玉米表达载体p1300-Zm13-argE的构建第105-106页

   ·玉米幼胚及胚性愈伤的遗传转化第106页

     ·农杆菌介导的玉米愈伤的遗传转化第106页

     ·农杆菌介导的幼胚的遗传转化第106页

   ·转基因植株的分子检测第106-107页

     ·抗性植株的PCR检测第106-107页

     ·PCR阳性植株的PCR-Southern检测第107页

       ·杂交探针的获得第107页

       ·PCR-Southern杂交过程第107页

  第三节 结果与分析第107-110页

   1 脱乙酰酶基因argE的获得第107-108页

   2 玉米表达载体p1300-Zm13-argE的构建第108页

   3 农杆菌介导的玉米愈伤的遗传转化第108-109页

   4 转基因植株的分子检测第109-110页

  第四节 讨论第110-112页

   1 通过花粉特异启动子创建雄性不育系第110-111页

   2 通过外施N-乙酰-草丁膦诱导转argE基因植株雄性不育系策略的优缺点第111-112页

  第五节 小结第112-113页

参考文献第113-125页

致谢第125-126页

论文编号BS1148850，这篇论文共126页
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