肺脏特异性表达Cre重组酶转基因小型猪的建立

发布时间：2016-07-07 21:01

  本文关键词：肺脏特异性表达Cre重组酶转基因小型猪的建立，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2014年

肺脏特异性表达Cre重组酶转基因小型猪的建立

雒伟伟  

【摘要】：利用Cre/loxP系统制备条件性基因敲除小鼠动物模型是活体内研究基因功能的有效策略。然而，在某些方面，小鼠、大鼠等啮齿类动物并不适合于人类疾病模型。猪作为哺乳动物，在基因组水平、器官结构大小、生理特征等方面都与人类更接近。因此，人类疾病的猪动物模型能够更好地反应疾病的发生、发展过程和病理特征。在本实验中，利用猪体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer,SCNT）构建组织特异性表达Cre重组酶转基因小型猪，为进行组织特异性基因敲除小型猪动物模型构建提供Cre重组酶表达工具猪。 为了获得肾脏特异性表达Cre重组酶的转基因小型猪，我们选择猪源AQP2基因启动子区序列来驱动Cre重组酶表达。AQP2(Aquaporin2)属于水通道蛋白家族，主要表达于哺乳动物肾脏集合管细胞。基于小型猪体内AQP2表达分析结果与AQP2基因启动子区序列多重比对分析结果，选择猪源AQP2转录起始位点上游3,090bp序列来驱动Cre重组酶表达。构建的Cre表达载体命名为AQP2-Cre，全长11,045bp。载体瞬时转染五种细胞系：PK15、Hela、A549、HepG-2、LLC-PK1，并分析Cre重组酶表达情况。检测结果表明，AQP2-Cre在LLC-PK1细胞中表达，其它细胞系中不表达。 AQP2-Cre载体线性化后，转染中国实验小型猪胎儿成纤维细胞。利用含G418(450μg/ml)的选择性DMEM培养基筛选14天左右，获得具有neo抗性的细胞克隆。提取细胞克隆基因组DNA，利用跨Cre表达序列与AQP2基因启动子区序列的跨区检测引物进行PCR鉴定，并测序鉴定。选取三株细胞状态良好的阳性AQP2-Cre转基因细胞克隆作为核供体细胞，共制备1427枚重构胚，分别输入到5头待孕母猪输卵管。结果，3头受孕母猪顺利分娩，共获得12头克隆小型猪（均来自同一细胞克隆）。利用AQP2-Cre跨区检测引物鉴定新生克隆小型猪，结果表明12头全部为阳性。测序结果表明转基因小型猪基因组整合了完整的Cre表达序列。 利用RT-PCR与western blotting分析转基因小型猪Cre表达情况。检测结果显示，Cre重组酶表达于AQP2-Cre转基因小型猪肺脏组织，其它组织中不表达。免疫组化分析结果表明，Cre重组酶表达于肺泡上皮细胞，且细胞质与细胞核均有表达。 利用反向PCR (Inverse PCR)分析外源基因在AQP2-Cre转基因小型猪基因组上的整合位点，利用绝对定量PCR (Absolutly qRT-PCR)分析各转基因小型猪基因组的Cre拷贝数。共检测到4个AQP2-Cre整合位点，Cre拷贝数为8-12。不同转基因小型猪，或同一转基因小型猪各组织基因组样本中，Cre拷贝数差异均不明显（P0.5）。随后，检测了5头不同月龄(新生、1月龄、5月龄、10月龄、15月龄)转基因小型猪肺组织基因组中AQP2-Cre整合情况，并利用相对定量PCR (Relative qRT-PCR)分析了Cre重组酶的表达变化。分析结果表明，不同月龄AQP2-Cre转基因小型猪，Cre拷贝数无明显变化(P0.5)，且Cre重组酶能够稳定表达(P0.5)。 为进一步分析Cre重组酶在传代过程中的表达变化，我们选择5月龄转基因小型猪与正常非转基因小型猪杂交，获得3头为阳性AQP2-Cre转基因小型猪。分析结果表明F1代阳性转基因小型猪同样为肺泡上皮细胞特异性表达Cre重组酶。AQP2-Cre整合情况分析结果表明，F1代转基因小型猪基因组样本中Cre拷贝数为5-6。相比较于F0代转基因小型猪，Cre拷贝数明显减少(P0.05)，且其中一头转基因小型猪基因组中只检测到3个整合位点。利用相对定量PCR方法分析转基因小型猪传代过程中Cre重组酶表达水平变化。结果显示，，传代后Cre重组酶表达量无明显变化(P0.05)。 在本实验中，虽然没有明确导致AQP2-Cre转基因猪肺脏特异性表达Cre重组酶的原因。但分析结果表明，本实验所制备AQP2-Cre转基因小型猪能够稳定表达Cre重组酶。结合实验室之前进行的Cre重组酶活性研究结果，认为该AQP2-Cre转基因小型猪能够应用于肺脏特异性基因敲除猪模型的构建。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q789
【目录】：

下载全文 更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？ 欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 刘录山;杨永宗;冯大明;孙文清;唐朝克;唐雅玲;易光辉;王佐;任重;王贵学;杨保堂;万载阳;;小型猪动脉粥样硬化斑块稳定性模型研究[J];生物化学与生物物理进展;2006年02期

2 张德福,刘东;国内外小型猪实验动物化研究[J];生物学通报;2004年10期

3 王爱德,甘世祥,魏泓,冯书堂;丹麦Gottingen小型猪科学考察报告[J];实验动物科学与管理;2002年01期

4 刘军须,刘福英,冯旭;建立小型猪Ⅰ型糖尿病模型的方法探讨[J];实验动物科学与管理;1998年02期

5 徐国会,励建安,陈亦江,施海彬,尹航,吴文霞,王连生,黄澎,袁红洁,王彤,周士枋;慢性冠状动脉狭窄及侧枝循环动物模型的建立[J];中国康复医学杂志;2001年03期

6 屈正,安春雷,党海明,李书闻,商建峰,王学勇,许斌;中国实验小型猪慢性心肌缺血模型的制备与研究[J];中华实验外科杂志;2001年03期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘涛;王伟;;证候动物模型研究的思索[J];中华中医药杂志;2006年09期

2 陈冬志;牛欣;杨学智;董晓英;张志国;高蔚;司银楚;;小型猪滑脉实验教学模型的建立[J];中华中医药杂志;2008年12期

3 陈学习;赵晓梅;;小型猪动物模型在医药学领域的研究应用与思考[J];福建中医学院学报;2010年04期

4 练有文,王晖;实验动物小型猪饲养管理的体会[J];广东医学院学报;2003年02期

5 范宏刚;胡魁;卢德章;张建涛;李静;于世明;王洪斌;;小型猪麻醉研究进展[J];中国畜牧兽医;2009年11期

6 熊忠良;汪宏才;赵海忠;甘伏生;余幼兰;程小荣;陈立新;;浅谈几种实验动物在兽用生物制品试验研究中的应用[J];湖北畜牧兽医;2010年08期

7 胡辉;余兴龙;李杰;肖朝庭;李润成;李斌;;猪呼吸道、消化道内细菌质粒的提取[J];湖北畜牧兽医;2011年09期

8 杨智;;建立我国全新实验动物伦理审查机制的可行性探讨[J];学理论;2009年25期

9 罗志强;屈正;张兆光;柳克晔;李彤;许斌;谭江宁;;直接心肌内注射碱性成纤维细胞生长因子基因改善慢性缺血心肌收缩功能的实验研究[J];中华老年心脑血管病杂志;2006年05期

10 唐永鑫;曾南;王建;张廷模;夏厚林;;病证结合“闭证”动物模型复制管见[J];辽宁中医杂志;2009年05期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 岳敏;范沛;巫玮;王玉珏;顾为望;;国内实验用小型猪循环系统疾病动物模型研究进展[A];第九届中国实验动物科学年会（2010新疆）论文集[C];2010年

2 袁进;顾为望;;小型猪作为人类疾病动物模型在生物医学研究中的应用前景[A];第九届中国实验动物科学年会（2010新疆）论文集[C];2010年

3 刘韬帅;屈正;何怡华;米宏志;刘东;许斌;;激光与VEGF基因心肌血运重建联合疗效的实验研究[A];大珩先生九十华诞文集暨中国光学学会2004年学术大会论文集[C];2004年

4 袁国强;贾振华;王宏涛;高怀林;魏聪;;“脉络病变”证候动物模型建立的思路与方法[A];首届中西医血管病学大会论文汇编[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 王皓;丙烯酰胺对雄性动物生殖及成体干细胞的毒理学研究[D];南京农业大学;2010年

2 李冠民;中国实验动物科学发展模式的分析与研究[D];中国农业大学;2005年

3 翟铁军;芪玄益心胶囊抗实验性糖尿病冠心病大鼠心肌缺血及对其细胞膜I_（tol）影响的研究[D];黑龙江中医药大学;2005年

4 于震;血栓性心肌缺血模型的建立及双参宁心胶囊的干预作用[D];中国中医科学院;2006年

5 崔立;实验用小型猪种群净化技术及其不同模型的建立和应用[D];南京农业大学;2005年

6 姚静;多巴酚丁胺—美托洛尔负荷超声心动图结合多普勒组织成像诊断冠心病的基础与临床研究[D];南京医科大学;2006年

7 尹倪;大鼠骨髓间充质干细胞缺血心肌移植的时效性研究[D];中南大学;2006年

8 李军;蔷薇红景天滴丸的制备及其对心肌梗塞影响的研究[D];新疆医科大学;2006年

9 王强;完全胸腔镜下心脏分子搭桥与冠脉搭桥的实验研究[D];复旦大学;2006年

10 刘涛;气虚血瘀证（心肌缺血）动物模型及蛋白质组学研究[D];北京中医药大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 姜海英;不同频率电针预处理对急性心肌缺血家兔模型保护作用的对比研究[D];黑龙江中医药大学;2010年

2 王茁伉;脑络舒宁胶囊治疗高脂血症的实验研究[D];成都中医药大学;2010年

3 唐永鑫;四味芳香开窍药抗急性脑缺血的实验研究及药性初探[D];成都中医药大学;2010年

4 郎松;中国特有小型猪IGFs基因的SNP分析及其在相关组织中表达规律的研究[D];吉林大学;2011年

5 段超伟;实验用巴马香猪繁殖性能与仔猪生长发育性能测定[D];西南大学;2012年

6 袁红洁;有氧训练对慢性冠状动脉狭窄猪心肌VEGF表达的影响[D];南京医科大学;2002年

7 黄澎;有氧运动训练对猪慢性冠状动脉狭窄模型侧支循环生成的影响[D];南京医科大学;2002年

8 陈炜;犬下腔静脉狭窄扩张后管壁生物力学特征改变与再狭窄关系研究及影像学评价方法的比较研究[D];第二军医大学;2004年

9 岑彦艳;洛伐他汀在巴马香猪体内的药代动力学研究[D];第三军医大学;2006年

10 任丽华;西藏小型猪实验动物化的初步研究[D];第一军医大学;2006年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 孙立军,李敬帮,郭庆林,余厚军,张迎光,孟庆江,王志远,黄志兰,贺洪德;闭胸制备犬慢性心肌缺血和梗塞模型[J];第四军医大学学报;1997年01期

2 张德福,丁卫星;小型猪研究的现状及其进展[J];国外畜牧学(猪与禽);1997年01期

3 唐朝克,冯大明,孙文清,刘录山,易光辉,杨峻浩,王佐,王双,万载阳,杨保堂,杨永宗;动脉粥样硬化小型猪三磷酸腺苷结合盒转运体A1表达的变化[J];生物化学与生物物理进展;2005年03期

4 邵政一;实验性糖尿病动物的植物性神经病变[J];生理科学进展;1984年04期

5 尹海芳,李宁;猪作为异种器官移植供体的研究进展[J];生物技术通讯;2001年04期

6 陈文强,张运,张梅,季晓平,林晨,朱永锋,张伟,王荣,刘彦,姚桂华;外源性人野生型p53基因转染导致兔动脉硬化斑块的不稳定性[J];中华医学杂志;2004年01期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王剑,张莉,毛春明,程萱,侯宁,吕娅歆,杨晓;心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[J];军事医学科学院院刊;2005年01期

2 程萱,滕艳,谭晓红,王剑,孙安娜,杨晓;特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的方法[J];生物技术通讯;2005年02期

3 王友亮,程萱,崔芳,程竞,吕娅歆,杨晓;肝细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[J];中华肝脏病杂志;2004年03期

4 杨蕾蕾,吴壮,程萱,徐军,杨晓;平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[J];军事医学科学院院刊;2005年03期

5 周江,杨晓,程萱,程静,黄翠芬;Cre重组酶表达载体的构建及其在转基因小鼠胰腺中的表达[J];生物技术通讯;2002年06期

6 毛春明,杨晓,程萱,吕娅歆,周江,黄翠芬;角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[J];遗传学报;2003年05期

7 朱焕章,曹莹莹,成国祥,薛京伦;配体依赖性Cre重组酶在培养肝细胞中介导条件性基因激活(英文)[J];生物化学与生物物理学报;2003年05期

8 郑敬民,李坚,杨桦,傅继梁;基于Cre重组酶体系的小鼠HPRT定点整合打靶载体的构建及其应用[J];第二军医大学学报;2001年06期

9 董铭,于澎,饶明俐,于涌;knock-in法建立Cre重组酶表达鼠系[J];哈尔滨医科大学学报;2002年01期

10 郭中敏,徐康,岳颖,黄冰,唐欢,马芸,洪迅,陈系古,肖东;细胞可透过性Cre重组酶表达、纯化及生物活性检测(英文)[J];生物化学与生物物理进展;2004年09期

中国重要会议论文全文数据库 前5条

1 王友亮;程萱;程竟;崔芳;吕娅歆;杨晓;;肝脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年

2 仇海燕;陈生弟;;中脑多巴胺能神经元诱导型表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

3 秦瑶;朱作言;汪亚平;;斑马鱼胚胎中Cre／lox介导的定点整合[A];湖北省遗传学会、江西省遗传学会2006年学术年会暨学术讨论会论文摘要集[C];2006年

4 侯宁;王剑;李文龙;张继帅;杨晓;;心脏和软骨组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的基因型鉴定[A];中国遗传学会七届一次青年研讨会暨上海高校模式生物E——研究院第一届模式生物学术研讨会论文汇编[C];2005年

5 周江;程萱;孙彦洵;吕娅歆;程静;黄培堂;黄翠芬;杨晓;;基于Cre/LoxP系统的Smad2条件基因剔除小鼠的建立[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

中国博士学位论文全文数据库 前6条

1 雒伟伟;肺脏特异性表达Cre重组酶转基因小型猪的建立[D];吉林大学;2014年

2 赵增明;胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的构建[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年

3 黄兵;表达禽流感病毒H5血凝素禽腺病毒重组体的构建及其特性研究[D];南京农业大学;2005年

4 陈明;可诱导转基因植物雄性不育的研究[D];中国农业科学院;2003年

5 绳纪坡;蜕皮激素诱导人IGF-Ⅰ在中枢神经系统特异性表达的转基因小鼠模型的建立[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

6 张继帅;利用条件基因剔除技术研究Smad4基因在软骨内成骨过程中的功能[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 时令;Ⅱ型肺上皮细胞表达Cre重组酶转基因小鼠的建立[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

2 万海峰;骨关节炎相关Smad3突变基因的克隆及其初步的功能分析[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

3 王敏;CMV-Cre-EGFP转基因小鼠的建立[D];福建医科大学;2009年

4 杨春;肝特异性表达Cre重组酶载体和转基因猪成纤维细胞的构建[D];吉林大学;2008年

5 徐瑛;神经细胞特异性Cre重组酶表达载体的构建及其体外表达研究[D];福建医科大学;2008年

6 胥珊;几种不同NLS对重组酶删除效率影响的初步研究[D];西南大学;2009年

7 杨丽华;四环素诱导的Cre重组酶表达载体的构建及其体外表达研究[D];福建医科大学;2009年

8 吴少璞;功能性稳定表达Cre重组酶的vero-Cre细胞系的构建[D];郑州大学;2009年

9 陈兴启;基因打靶载体pA2TR的构建[D];西北农林科技大学;2008年

10 谭虎;HD5与GLP2表达载体构建及其对放烧伤小鼠肠源性感染的影响[D];第三军医大学;2004年

  本文关键词：肺脏特异性表达Cre重组酶转基因小型猪的建立，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：66762