马铃薯StNCED1基因的克隆及其功能研究

发布时间：2017-08-20 10:23

  本文关键词：马铃薯StNCED1基因的克隆及其功能研究

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【摘要】：植物体内ABA合成代谢中的限速酶—9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)可以调节控制植物体内脱落酸(ABA)的生物合成。ABA合成代谢C40途径中的第一个C15中间体黄质醛是由NCED催化新黄质产生的,黄质醛是ABA合成代谢中的核心产物。本论文以马铃薯栽培品种“陇薯3号”为试验材料,根据Gen Bank已报道的StNCED1基因序列设计特异引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法获得了马铃薯StNCED1基因的cDNA序列,分别构建了StNCED1基因的过表达载体pBIC-StNCED1和人工microRNA干扰表达载体pCBP121-amiRNA,通过根癌农杆菌介导转化马铃薯栽培品种“陇薯3号”获得了转基因植株,对转基因马铃薯中StNCED1基因的相对表达量和ABA含量进行了测定,为研究StNCED1基因的功能奠定了基础。取得的主要研究结果如下:1.通过RT-PCR技术从马铃薯栽培品种“陇薯3号”中获得了StNCED1基因的cDNA序列,生物信息学分析表明cDNA全长1952 bp,编码区序列长1815 bp,与番茄slNCED1基因的同源性达95%。马铃薯StNCED1基因编码的氨基酸序列分析表明,NCED由603个氨基酸组成,分子量为67.132 kDa,PI为6.16,氨基酸序列比对与番茄的同源率最高,可达98%。2.将StNCED1基因与表达载体pBIC连接获得了植物表达载体pBIC-StNCED1。另外,通过WMD3软件平台设计获得了可以特异性沉默StNCED1基因的ami RNA成熟序列,然后用重叠PCR技术克隆获得了amiRNA前体序列。将amiRNA前体序列与表达载体pCBP121连接,获得干扰表达载体pCBP121-amiRNA。3.通过根癌农杆菌介导法,用含有质粒pBIC-StNCED1和干扰表达载体pCBP121-amiRNA的农杆菌转化马铃薯栽培品种“陇薯3号”获得了转化植株,经过卡那霉素抗性筛选和PCR扩增检测,分别获得5株(pBIC-StNCED1)和6株(pCBP121-amiRNA)转基因植株。4.诱导转基因植株获得了试管薯,对试管薯中StNCED1基因的相对表达量和ABA含量进行了测定,结果表明在转StNCED1基因植株1-5的试管薯中StNCED1基因的相对表达量分别上调2-8倍,ABA含量分别是非转基因植株试管薯的1.10-1.76倍。在干扰表达StNCED1基因的转基因植株1-6的试管薯中,StNCED1基因的相对表达量分别下调53%-85%,ABA的含量下降了34%-51%。总之,通过调节马铃薯中StNCED1基因的表达可以调节NCED的合成进而调节ABA的含量,从而说明StNCED1基因在ABA的合成代谢中起重要的调控作用,为进一步阐明StNCED1基因的功能奠定了基础。
【关键词】：马铃薯 ABA StNCED1基因 amiRNA 遗传转化
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S532;Q943.2
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 第一章 文献综述10-17
• 1.1 马铃薯的休眠10
• 1.2 脱落酸与马铃薯休眠10-12
• 1.2.1 脱落酸的生理功能10-11
• 1.2.2 脱落酸的生物合成和分解代谢11
• 1.2.3 脱落酸与马铃薯休眠11-12
• 1.2.4 脱落酸合成代谢中的 9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶12
• 1.2.5 对ABA进行分子调控的研究12
• 1.3 人工miRNA介导的基因沉默12-15
• 1.3.1 基因沉默技术12-13
• 1.3.2 植物miRNA的合成及其作用方式13-14
• 1.3.3 植物人工miRNA介导的基因沉默14-15
• 1.4 本研究的目的意义和技术路线15-17
• 1.4.1 本研究的目的和意义15-16
• 1.4.2 技术路线16-17
• 第二章 马铃薯StNCED1基因的克隆及生物信息学分析17-27
• 2.1 实验材料17
• 2.1.1 植物材料17
• 2.1.2 菌株和载体17
• 2.1.3 试剂与工具酶17
• 2.1.4 培养基17
• 2.2 实验方法17-21
• 2.2.1 马铃薯StNCED1基因的克隆17-21
• 2.2.2 马铃薯StNCED1基因和蛋白的同源性分析21
• 2.3 结果与分析21-26
• 2.3.1 马铃薯StNCED1基因的克隆21-23
• 2.3.2 生物信息学分析23-26
• 2.4 讨论26-27
• 第三章 植物表达载体与人工microRNA干扰载体的构建27-38
• 3.1 实验材料27
• 3.1.1 质粒和菌株27
• 3.1.2 试剂与工具酶27
• 3.2 实验方法27-33
• 3.2.1 StNCED1基因过表达载体的构建27-28
• 3.2.2 人工microRNA干扰载体的构建28-33
• 3.3 结果与分析33-36
• 3.3.1 pBIC- StNCED1过表达载体的PCR扩增检测和酶切鉴定33-34
• 3.3.2 人工microRNA干扰载体的构建34-36
• 3.4 讨论36-38
• 第四章 StNCED1基因转化马铃薯及脱落酸含量的测定38-48
• 4.1 实验材料38
• 4.1.1 植物材料与菌株38
• 4.1.2 酶与试剂38
• 4.1.3 培养基38
• 4.2 实验方法38-42
• 4.2.1 农杆菌转化马铃薯38-39
• 4.2.2 转化植株的获得与检测39-40
• 4.2.3 转基因试管薯的qRT-PCR表达分析40-41
• 4.2.4 转基因试管薯的脱落酸测定41-42
• 4.3 结果与分析42-46
• 4.3.1 转化植株的获得42
• 4.3.2 转化植株的的PCR检测42-43
• 4.3.3 qRT-PCR分析StNCED1基因的相对表达量43-44
• 4.3.4 脱落酸的含量的测定与分析44-46
• 4.4 讨论46-48
• 第五章 结论48-49
• 参考文献49-56
• 致谢56-57
• 作者介绍57-58
• 导师简介58-59

【参考文献】

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