VIGS技术高通量筛选棉花抗黄萎病相关基因

发布时间：2017-08-21 09:06

  本文关键词：VIGS技术高通量筛选棉花抗黄萎病相关基因

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【摘要】：棉花黄萎病是由黄萎病菌引起的一种土传真菌维管束病害，严重危害棉花的生产，被称为“棉花的癌症”。棉花黄萎病危害严重，难以防控，很大程度上归咎于抗黄萎病抗源的缺乏，及对棉花抗黄萎病分子机理研究的欠缺，再加上生产上缺少行之有效的防控技术和措施。从基因水平上揭示棉花抗黄萎病的特征和机制，依然是揭示棉花抗黄萎病分子机理，提高棉花对黄萎病抗性的基础工作。然而长期以来，因受到研究材料的限制，以及研究手段的欠缺，从基因水平上去研究和探索棉花抗黄萎病分子机理难度很大。病毒介导的基因沉默技术（virus induced gene silencing，VIGS）是利用反向遗传学策略揭示植物基因功能的重要技术之一，，为从基因水平上揭示棉花抗黄萎病的分子机制提供了新的契机。 本研究以中国农业科学院植物保护研究所棉花病害组选育的陆地棉(Gossypiumhirsutum)抗黄萎病品系——中植棉KV3为材料，在实验室前期抑制差减杂交和基因芯片分析的基础上，初步挑选出106个可能与棉花抗黄萎病相关的基因，并用病毒介导的基因沉默技术（virus induced gene silencing，VIGS）研究这些基因在棉花抗黄萎病中的作用和功能。所利用的VIGS载体为棉叶皱缩病毒（Cotton leaf crumple virus,CLCrV）改造。总共成功构建了6大类，62个VIGS基因载体。所构建的载体导入农杆菌后，用农杆菌侵染法进行基因沉默实验，靶向性沉默相对应的基因，然后用伤根法接种黄萎病菌，检测基因沉默棉花植株对棉花黄萎病抗性的变化情况。由此，利用VIGS这一反向遗传学的技术高通量地筛选出棉花抗黄萎病相关基因，为棉花抗黄萎病机制的研究，以及棉花抗病品种分子选育提供基础性工作。主要研究结果如下： 1.利用CLCrV诱导的基因沉默体系，靶向性沉默叶绿素合成相关基因CHLI和CLA1，基因沉默后植株的叶片表现出明显的黄化和白化表型；还确认了目的基因沉默植株中，目的基因的表达量也明显降低；且空载体转化对照植株与野生型植株对黄萎病菌的抗性无明显差异；说明该体系在中植棉KV3中可沉默目的基因，用于目的基因功能的研究； 2.运用VIGS技术高通量筛选棉花抗黄萎病相关基因，三轮重复试验筛选出8个与棉花抗、感黄萎病相关的基因。其中6个基因[Gh39（bZIP）、Gh24（GRAS）、Gh58（WRKY）、Gh55（EIN2）、Gh114（XTH）、Gh97（Drigent-like protein）]正调控棉花对黄萎病的抗性，2个基因[Gh15（bZIP）、Gh31（NAC5）]负调控棉花对黄萎病的抗性； 3.对其中的3个基因进行功能注释与表达特性分析。结果显示：Gh55为乙烯信号途径中的正向调控因子EIN2，利用VIGS技术沉默该基因，沉默植株接种黄萎病菌后，病症明显加重，说明该基因是一棉花黄萎病的正调控基因；沉默Gh97（Dirigent-like protein）的植株接种黄萎病菌后，症状显著加重，聚类分析结果显示该基因属于DIRb/d家族，且在根部的表达量很高，这些结果说明，Gh97可能在根部介导细胞发生木质化，从而阻止了黄萎病菌的入侵及繁殖，提高了棉花对黄萎病菌的抗性；Gh114是一种木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)，沉默该基因的植株对黄萎病菌更敏感，表明该基因可能通过改变植物细胞壁的结构，参与棉花对黄萎病菌的抗性。
【关键词】：棉花黄萎病 VIGS 高通量筛选 抗性相关基因
【学位授予单位】：山西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S562
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 英文缩略表9-13
• 1 绪论13-25
• 1.1 棉花黄萎病13-20
• 1.1.1 棉花黄萎病的危害13
• 1.1.2 棉花黄萎病菌的生物学特性13-14
• 1.1.3 棉花黄萎病菌的侵染过程及致病机理14-16
• 1.1.4 棉花的抗病机理16-20
• 1.2 病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silence）20-22
• 1.2.1 VIGS 的机制20-21
• 1.2.2 VIGS 技术的建立、发展及运用21-22
• 1.2.3 VIGS 技术的优点及局限性22
• 1.3 本研究的目的与意义22-25
• 2 材料与方法25-37
• 2.1 材料与仪器25-26
• 2.1.1 材料25
• 2.1.2 试剂与仪器25-26
• 2.2 实验方法26-37
• 2.2.1 棉花材料的培养26
• 2.2.2 病原菌培养及接种方法26
• 2.2.3 VIGS 载体的构建26-33
• 2.2.4 农杆菌浸染的 VIGS 接种方法33
• 2.2.5 荧光定量 PCR 检测目的基因表达量33-35
• 2.2.6 沉默植株抗病性检测35-36
• 2.2.7 组织特异性检测36-37
• 3 结果与分析37-55
• 3.1 基因的挑选37
• 3.2 VIGS 载体的构建37-41
• 3.2.1 构建 VIGS 载体37-39
• 3.2.2 成功构建的 VIGS 载体39-41
• 3.3 阳性对照基因验证 VIGS 沉默体系41-42
• 3.4 qPCR 检测目的基因的沉默效率42-43
• 3.5 利用 VIGS 技术高通量筛选棉花抗黄萎病相关基因43-44
• 3.6 接菌后表型及症状44-47
• 3.7 部分抗病相关基因功能注释及表达特征分析47-55
• 3.7.1 乙烯相关基因47-50
• 3.7.2 抗病相关基因50-52
• 3.7.3 细胞壁重构相关基因52-55
• 4 讨论55-57
• 5 结论57-59
• 致谢59-61
• 参考文献61-71
• 附录 A71-74
• 附件 B74-81
• 附录 C：攻读硕士期间发表的论文81

【参考文献】

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本文编号：711989