狂犬病病毒基因工程疫苗制备及基因治疗载体的改造

发布时间：2017-08-21 13:33

  本文关键词：狂犬病病毒基因工程疫苗制备及基因治疗载体的改造

  更多相关文章： 狂犬病病毒 糖蛋白 腺相关病毒 疫苗 多克隆抗体 神经嗜性 神经退行性疾病 基因治疗 细胞系构建 CRISPR

【摘要】：狂犬病毒是由弹状病毒科狂犬病毒属的成员,它是一种单股负链RNA病毒,其基因组主要编码5种结构蛋白,从3’端到5’端依次为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。其中,G蛋白不仅是唯一可以诱导机体发生免疫反应产生中和抗体的抗原蛋白,还决定病毒的细胞嗜性和病毒吸附细胞的能力,从而使狂犬病毒具有强烈的神经嗜性。狂犬病是狂犬病毒引起的一种人畜共患、急性、致死性的传染病,机体一旦感染发病,死亡率100%。目前,尚无有效的治疗方式,暴露前疫苗免疫是最好的预防措施。同时,由于狂犬病毒G蛋白在体外难以表达纯化,所以G蛋白多克隆抗体和单克隆抗体难以制备。基于以上背景,本课题主要从以下3个方面进行:1.狂犬病毒亚单位疫苗的制备根据G蛋白可以诱导机体产生中和抗体的特点,使用具有安全性高,免疫原性低、表达持续时间长等优点的腺相关病毒表达载体AAV病毒载体表达G蛋白,制备一种新型的亚单位疫苗。本课题选取了狂犬病毒疫苗株SADL16的G蛋白(包括第194、333位氨基酸突变和未突变类型)、、B2C株G蛋白及N2C株G蛋白作为表达对象。同时我们在表达载体中插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)以提高G蛋白表达量。质粒构建完成后在HEK-293T细胞系上包装成能表达G蛋白的亚单位疫苗,经过滴度测定、G蛋白表达检测后,通过肌肉注射免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,然后分别在免疫后第1、2、3、9月末检测小鼠体内中和抗体水平。结果表明,免疫组小鼠产生较高水平的中和抗体,且比疫苗对照组存在明显的优势。为了检测抗体是否可以在狂犬病毒感染后产生保护力,以50倍的狂犬病毒CVS-24株半数致死剂量进行病毒感染实验。攻毒实验表明,该表达G蛋白的AAV亚单位疫苗可以为机体提供有效的保护力。与其他疫苗相比,该疫苗具有成本低、免疫程序简单(只需一次免疫即可)、贮存和运输条件要求低(4℃)以及抗体水平持续时间长等优点。2.G蛋白多克隆抗体的快速制备由于G蛋白在体外难以表达纯化,可以利用表达G蛋白的AAV重组病毒免疫小鼠,然后收集其血清作为G蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光实验结果也表明,可以利用此方法快速制备G蛋白的多克隆抗体。3.狂犬病毒作为基因治疗载体的改造由于狂犬病毒具有严格的嗜神经性,我们尝试逐步改造狂犬病毒,提高其安全性,并最终作为神经退行性疾病基因治疗的转移载体使用。首先,我们将BDNF、NGF插入缺失G蛋白的狂犬病毒基因组,然后在此基础上再缺失狂犬病毒M蛋白和P蛋白。目前,狂犬病毒G蛋白缺失株已经在B7GG细胞系拯救完成,后者由于没有对应的细胞系可以完成病毒的拯救,所以我们利用CRISPR技术在B7GG细胞系基础上构建同时表达M、P、G蛋白的细胞系。同时,本课题以AAV重组病毒过表达α-突触核蛋白构建帕金森综合征(Parkinson’s disease,PD)疾病模型,目前已完成了前期的质粒构建及病毒包装工作。目前没有细胞系可以用于缺失M、P蛋白的狂犬病毒的拯救,所以我们B7GG细胞系的基础上,利用CRISPR技术将狂犬病毒的M、P蛋白敲入B7GG细胞基因组,构建同时表达狂犬病毒M、P、G蛋白的细胞系。在此过程,我们将B7GG细胞系中绿色荧光蛋白(GFP)替换为红色荧光蛋白(m Cherry)以便于细胞筛选工作,同时将潮霉素基因也克隆到该细胞系利于细胞的抗性筛选。将重组目的基因片段与g RNA共转染B7GG细胞后,经过潮霉素和流式筛选,我们易获得同时表达M、P、G蛋白的细胞系(B7CMPG)。
【关键词】：狂犬病病毒 糖蛋白 腺相关病毒 疫苗 多克隆抗体 神经嗜性 神经退行性疾病 基因治疗 细胞系构建 CRISPR
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表（Abbreviation）10-12
• 第1章 文献综述12-18
• 引言12
• 1.1 狂犬病及其流行概述12
• 1.2 狂犬病毒研究进展12-14
• 1.2.1 狂犬病毒的分类12-13
• 1.2.2 狂犬病毒结构基因13-14
• 1.2.3 狂犬病毒的免疫原性和嗜神经性14
• 1.3 狂犬病疫苗研究现状14-15
• 1.3.1 狂犬病疫苗分类14-15
• 1.3.2 狂犬病疫苗研究进展15
• 1.4 神经退行性疾病概述15-16
• 1.5 基因治疗研究进展16
• 1.5.1 基因治疗概述16
• 1.5.2 基因治疗病毒性转运载体16
• 1.6 CRISPR-Cas系统与基因编辑16-18
• 第2章 目的与意义18-19
• 2.1 狂犬病重组AAV亚单位疫苗及G蛋白多克隆抗体的快速制备18
• 2.2 狂犬病毒作为神经退行性疾病基因治疗载体的初步探究18-19
• 第3章 狂犬病重组AAV亚单位疫苗及G蛋白多克隆抗体的快速制备19-48
• 3.1 试验材料19-22
• 3.1.1 细胞、病毒、质粒及培养条件19
• 3.1.2 实验动物19
• 3.1.3 实验仪器及耗材19-20
• 3.1.4 主要的工具酶、抗体、试剂及标准血清20
• 3.1.5 主要培养基、抗生素及其配置20-21
• 3.1.6 缓冲液及其配置21-22
• 3.1.7 主要的生物学分析软件22
• 3.2 试验方法22-36
• 3.2.1 以氯化钙法制备感受态细胞22
• 3.2.2 相关引物的设计及合成22-24
• 3.2.3 重组腺相关病毒感染性克隆的构建24-30
• 3.2.4 rAAV病毒包装30-31
• 3.2.5 rAAV滴度测定-间接免疫荧光试验31-32
• 3.2.6 Western blot检测G蛋白表达32-33
• 3.2.7 小鼠免疫实验33-34
• 3.2.8 中和抗体水平检测- FAVN法34-35
• 3.2.9 小鼠攻毒试验（CVS-24）35
• 3.2.10 小鼠血清作为G蛋白多抗-免疫荧光检测试验35
• 3.2.11 脑内病毒含量检测35-36
• 3.3 结果和分析36-46
• 3.3.1 重组腺相关病毒(rAAV)感染性克隆质粒的构建及鉴定36-38
• 3.3.2 rAAV病毒包装、滴度测定及G蛋白表达检测38-40
• 3.3.3 中和抗体水平检测40-42
• 3.3.4 疫苗免疫保护力检测42-45
• 3.3.5 小鼠血清作为G蛋白多抗-免疫荧光检测试验45-46
• 3.4 讨论46-47
• 3.4.1 AAV病毒的包装及G蛋白表达检测46
• 3.4.2 AAV疫苗在小鼠体内诱导产生狂犬病毒中和抗体水平的检测46-47
• 3.4.3 攻毒实验结果分析47
• 3.4.4 快速制备狂犬病毒G蛋白多克隆抗体47
• 3.5 结论47-48
• 第4章 狂犬病毒作为神经退行性疾病基因治疗载体的初步探究48-66
• 4.1 实验材料48-51
• 4.1.1 细胞、病毒、质粒及培养条件48
• 4.1.2 实验动物48
• 4.1.3 实验仪器及耗材48-49
• 4.1.4 主要的工具酶、抗体、试剂及标准血清49
• 4.1.5 主要培养基、抗生素及其配置49-50
• 4.1.6 缓冲液及其配置50
• 4.1.7 主要的生物学分析软件50-51
• 4.2 实验方法51-60
• 4.2.1 相关引物的设计及合成51-54
• 4.2.2 狂犬病病毒感染性克隆质粒的构建54-56
• 4.2.3 稳定表达狂犬病毒P、M、G蛋白细胞系的构建56-59
• 4.2.4 狂犬病毒缺失株的拯救59-60
• 4.2.5 过表达 α-突触核蛋白进行PD小鼠模型的构建60
• 4.3 结果60-64
• 4.3.1 重组狂犬病毒感染性克隆质粒的构建60-62
• 4.3.2 重组狂犬病毒缺失株的拯救62-63
• 4.3.3 构建稳定表达狂犬病毒P、M、G蛋白细胞系63
• 4.3.4 PD小鼠模型的构建63-64
• 4.4 讨论64-65
• 4.4.1 狂犬病毒载体安全性64-65
• 4.4.2 稳定表达狂犬病毒P、M、G蛋白细胞系的构建65
• 4.5 结论65
• 4.6 后期工作65-66
• 参考文献66-73
• 致谢73

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