低温胁迫对黄姑鱼生理生化指标和Hsp70基因表达模式的影响

发布时间：2017-08-21 14:39

  本文关键词：低温胁迫对黄姑鱼生理生化指标和Hsp70基因表达模式的影响

  更多相关文章： 低温胁迫 半致死温度 SOD CAT Na~+/-K~+-ATP Hsp70 序列分析 表达分析

【摘要】：为了研究黄姑鱼(Nibea albiflora)在低温胁迫下行为表现、组织学、生理生化指标、以及相关耐寒基因表达的变化。通过实验生态学方法确定黄姑鱼的半致死低温,并研究低温胁迫对黄姑鱼行为表现、组织学指标和相关生理生化指标的影响,进一步克隆分离了黄姑鱼热应激蛋白70(Hsp70)基因核心序列并研究了其组织分布以及其在低温胁迫下基因和蛋白水平的表达差异。研究结果如下:(1)以18℃为对照组,设置5.5℃、6.5℃、7.5℃和8.5℃三个低温组,确定了黄姑鱼幼鱼12h对应的半致死温度并表征了极端低温下黄姑鱼组织及行为表现方面的变化。结果表明:水温5.5℃和6.5℃条件下,实验鱼在短时间内便出行为异常并分别在6h和9h内全部死亡。水温7.5℃条件下,实验鱼则在应激反应17min后有一个恢复身体平衡的过程,处理12h后半数实验鱼死亡;而8.5℃组和对照组则表现正常。因此确定了18℃驯养条件下黄姑鱼12h对应的半致死温度为7.5℃。取对照组(18℃)和低温处理组(7.5℃)鱼肌肉和鳃进行组织学石蜡切片,并拍照观察发现低温胁迫能导致鳃丝肿大、血管堵塞、鳃小片出现水样变质、空泡性恶化、表皮细胞大量破损等一系列症状。而肌肉组织则出现肌纤维肿大、肌纤维间隙扩大,排列疏松等现象。说明极端低温能造成黄姑鱼组织的严重损伤。(2)以18℃为对照组,设置8℃、10℃和14℃三个低温胁迫组,测定不同温度急性胁迫对黄姑鱼幼鱼超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及Na~+/-K~+-ATP酶活力的影响。研究结果表明,低温胁迫组(8℃、10℃和14℃)的SOD和CAT酶活力随着胁迫温度的降低及其胁迫时间的延长呈先升高后降低的趋势,在72h时恢复到对照组水平。肌肉中的Na~+/-K~+-ATP酶活力则随处理时间的延长呈现先降低后升高的趋势,10℃和14℃组能够在72h时恢复到对照组水平,而8℃组则在72h仍显著低于对照组。由此说明,SOD、CAT以及Na~+/-K~+-ATP参与了黄姑鱼低温胁迫应答过程,可以作为其低温胁迫应答的标志物。(3)采用RT-PCR的方法分离克隆出了黄姑鱼Hsp70基因cDNA核心序列,共2143bp,包括5’非编码区128bp、编码区1917bp以及3’非编码区98bp,同源性分析表明,黄姑鱼Hsp70氨基酸序列与大黄鱼、浉鱼等动物相似性高达99%。通过半定量RT-PCR的方法检测其在黄姑鱼肝脏、鳃、脾脏和肌肉等组织中的表达差异,结果表明,Hsp70 mRNA在黄姑鱼四种组织中均有表达,且各组织中表达量有所差异:肌肉和鳃丝中表达量高,其次是脾脏,肝脏最少。应用Real Time-PCR技术研究低温(10℃)胁迫对黄姑鱼肌肉中Hsp70 mRNA表达的影响。结果表明,低温胁迫下黄姑鱼肌肉Hsp70 mRNA水平呈先升高后降低的变化趋势,说明该基因的表达受低温应激调控。对低温胁迫下黄姑鱼肌肉Hsp70蛋白含量表达差异研究表明,低温胁迫下黄姑鱼肌肉的Hsp70蛋白含量随着处理时间的延长呈先升高后降低趋势,10℃和14℃组能够在72h时恢复到对照组水平,而8℃组则在72h仍显著高于对照组。
【关键词】：低温胁迫 半致死温度 SOD CAT Na~+/-K~+-ATP Hsp70 序列分析 表达分析
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-15
• 第一章 绪论15-21
• 1.1 水温与鱼类的关系15
• 1.2 低温胁迫对鱼类的影响15-19
• 1.2.1 研究鱼类低温胁迫的意义15
• 1.2.2 鱼类致死低温的研究进展15-16
• 1.2.3 鱼类应对低温刺激的反应16-18
• 1.2.4 鱼类Hsp70的研究进展18-19
• 1.3 本研究的主要目的与意义19-21
• 第二章 黄姑鱼半致死低温的研究及低温胁迫对黄姑鱼行为表现和组织学指标的影响21-26
• 2.1 材料和方法21-22
• 2.1.1 实验材料21
• 2.1.2 实验方法21-22
• 2.2 结果与分析22-24
• 2.2.1 行为表现及半致死温度22-23
• 2.2.2 组织学变化23-24
• 2.3 讨论24-25
• 2.4 小结25-26
• 第三章 低温胁迫对黄姑鱼相关生理生化指标的影响26-32
• 3.1 材料与方法26-27
• 3.1.1 实验材料26
• 3.1.2 实验方法26-27
• 3.1.3 数据分析27
• 3.2 结果27-30
• 3.2.1 不同温度处理的黄姑鱼组织的SOD酶活力比较27-28
• 3.2.2 不同温度处理的黄姑鱼组织中CAT酶活力比较28-30
• 3.2.3 不同温度处理黄姑鱼的肌肉中Na~+/-K~+-ATP酶活力比较30
• 3.3 讨论30-31
• 3.3.1 低温胁迫对黄姑鱼抗氧化酶活性的影响30-31
• 3.3.2 低温胁迫对黄姑鱼肌肉中Na~+/-K~+-ATPase活力的影响31
• 3.4 小结31-32
• 第四章 黄姑鱼耐低温相关基因Hsp70在低温胁迫前后的表达差异32-50
• 4.1 材料与方法32-40
• 4.1.1 材料32-34
• 4.1.2 实验流程34-35
• 4.1.3 基因克隆35-39
• 4.1.4 组织间差异表达分析39
• 4.1.5 低温胁迫下差异表达分析39-40
• 4.2 结果与分析40-46
• 4.2.1 总RNA的提取40-41
• 4.2.2 黄姑鱼Hsp70 cDNA核心序列41-42
• 4.2.3 序列分析及同源性比较42-44
• 4.2.4 蛋白结构和功能的预测44-45
• 4.2.5 黄姑鱼Hsp70基因的组织表达差异45
• 4.2.6 黄姑鱼Hsp70基因在低温胁迫下差异表达分析45-46
• 4.2.7 不同温度处理的黄姑鱼肌肉中Hsp70蛋白含量比较46
• 4.3 讨论46-49
• 4.3.1 黄姑鱼Hsp70 cDNA的分离及其序列分析46-47
• 4.3.2 黄姑鱼Hsp70 cDNA的空间表达47-48
• 4.3.3 低温胁迫对黄姑鱼Hsp70基因和蛋白表达水平的影响48-49
• 4.4 小结49-50
• 主要研究结论50-51
• 参考文献51-59
• 致谢59-60
• 在读期间发表的学术论文及研究成果60

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