猪流行性腹泻病毒ORF3基因的变异分析及其荧光定量RT-PCR检测方法的研究

发布时间：2017-08-26 01:27

  本文关键词：猪流行性腹泻病毒ORF3基因的变异分析及其荧光定量RT-PCR检测方法的研究

  更多相关文章： 猪流行性腹泻病毒 ORF3基因 变异分析 Eva Green荧光定量RT-PCR

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种仔猪急性肠道传染病,该病给全球养猪业造成了巨大的经济损失,成为当前共同关注的猪病问题。适时掌握PEDV流行毒株的分子特征并进行快速诊断防控对该病具有重要意义。本研究开展了PEDV ORF3基因的克隆与变异分析,再以此为基础建立了可快速检测PEDV的Eva Green荧光定量RT-PCR方法,为PED的诊断提供新的技术支持。1 PEDVORF3基因的变异分析根据GenBank中PEDV CV777株ORF3基因序列,设计特异性引物,用RT-PCR扩增了2014-2015年四川、重庆、福建、黑龙江等地共21个代表性的ORF3基因,并构建重组质粒,进行了基因测序和变异分析。结果显示,21个ORF3基因全长675 bp,编码224个氨基酸。ORF3基因没有碱基缺失,只有碱基突变,而且多以C→T、T→C、G→A、A→T等突变形式存在,氨基酸突变多以Val→Ala、Phe→Val、Ala→Thr、Asn→Ser等突变形式存在。21个ORF3序列的核苷酸和氨基酸序列相似性为分别98.1%～100%和96.4%～100%；而与CV777标准株相比,核酸序列相似性在95.9%～99.6%,氨基酸序列相似性在94.2%～99.6%。经过遗传进化分析,绘制系统发育树后21个ORF3序列和参考序列可分成三个组,即G1、G2和G3。我国的21个PEDV属于G3组,与韩国株(2008-2012)、美国株(2014)、德国株(2014)以及部分前期中国株(2012-2014)位于同一分支,但与G1群的英国株(Brl/87)和标准株(CV777)等、G2群的DR13弱毒株亲缘关系较远。2 Eva Green荧光定量RT-PCR检测PEDV方法的研究根据GenBank中PEDV CV777株及Attenuated DR13株ORF3基因序列,设计一对特异性引物,以野毒和疫苗毒的cDNA为模板,采用RT-PCR扩增并构建了2个重组质粒,经核酸蛋白仪测定OD_(280)和OD_(260)值后,计算得到的拷贝数分别是4.79×10~(11)copies/μL和5.17×10~(11)copies/μL。在优化条件(引物浓度和退火温度)后,野毒和疫苗质粒浓度分别为4.79×10~3copies/μL～4.79×10~8 copies/μL和5.17×10~3 copies/μL～5.17×10~8 copies/μL时,绘制标准曲线及熔解曲线,构建Eva Green荧光定量RT-PCR检测方法(Eva Green real time quantitative PCR,简称EG-qRT-PCR)。通过检测PEDV、TGEV、JEV、PoRV、PRRSV、 PCV、PRV和PPV,只有PEDV有扩增峰,证明特异性良好；EG-qRT-PCR及RT-PCR可检测的最低浓度分别为100 copies/μL、10~3 copies/μL;强(弱)毒的组内和组间重复试验显示,变异系数都小于0.56%(0.82%)和1.05%(1.02%),重复性良好。用该方法检测了2014-2016四川地区共130份仔猪腹泻病料,EG-qRT-PCR和RT-PCR阳性检出率分别为72.31%(94/130)、58.46%(76/130)，，阳性样品的PEDV浓度为5.13×105 copies/μL～6.31×10~(10) copies/μL。用该方法初步测定了我国市售PEDV疫苗含量,结果显示弱毒活疫苗PEDV含量可以达到2.49×10~8 copies/μL,但是灭活疫苗中PEDV检出含量较低,最高只有5.80×10~2 copies/μL。以EG-qRT-PCR测定了临床发病猪的心、肝、脾、肺、肾、肠淋巴结和肠组织的PEDV含量后,病毒检出浓度分别为3.09×10~5～4.47×10~8 copies/μL,8.91×10~4～1.38×10~8 copies/μL,0～6.61×10~5 copies/μL,0～3.16×10~6 copies/μL,4.79×10~5～6.31×10~8 copies/μL,1.12×10~7～9.12×10~9 copies/μL,3.55×10~9～3.16×10~(12) copies/μL,其中肠组织PEDV含量最多,其次为肠淋巴结；在这些组织中脾肺组织的检出率最低,偶尔可以检测到。
【关键词】：猪流行性腹泻病毒 ORF3基因 变异分析 Eva Green荧光定量RT-PCR
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩略词表8-13
• 第一部分 文献综述13-25
• 1 PEDV概述13-19
• 1.1 PEDV的形态结构13
• 1.2 PEDV基因组结构特点13-17
• 1.2.1 复制酶多聚酶基因14-15
• 1.2.2 结构基因15-16
• 1.2.3 ORF3基因16-17
• 1.3 PEDV病原学特性17
• 1.4 PEDV致病机理17-18
• 1.5 PEDV临床症状18
• 1.6 PEDV病理变化18
• 1.7 PEDV流行情况18-19
• 2 PEDV诊断方法研究进展19-24
• 2.1 病原学检测19
• 2.1.1 分离鉴定19
• 2.2 免疫学方法19-21
• 2.2.1 免疫电镜法19-20
• 2.2.2 免疫荧光法20
• 2.2.3 血清中和试验20
• 2.2.4 酶联免疫吸附试验20-21
• 2.2.5 免疫胶体金技术21
• 2.3 分子生物学技术21-24
• 2.3.1 核酸探针杂交技术21
• 2.3.2 RT-PCR法21-22
• 2.3.3 逆转录-环介导等温核酸扩增技术22
• 2.3.4 原位PCR法22
• 2.3.5 巢式PCR22-23
• 2.3.6 限制性片段长度多态性分析23
• 2.3.7 实时荧光定量RT-PCR23-24
• 3 本研究的目的与意义24-25
• 第二部分 研究内容25-61
• 第一章 PEDV ORF3基因的变异分析25-40
• 1 材料25
• 1.1 菌株、质粒25
• 1.2 主要试剂25
• 1.3 主要仪器25
• 2 方法25-30
• 2.1 引物设计25-26
• 2.2 PEDV ORF3基因的克隆26-30
• 2.2.1 PEDV RNA的提取26
• 2.2.2 PEDV PCR26-27
• 2.2.3 PEDV ORF3基因的克隆27-30
• 2.2.4 PEDV ORF3基因遗传进化分析30
• 3 结果30-38
• 3.1 RT-PCR鉴定结果30-31
• 3.2 PEDV ORF3基因序列分析31-34
• 3.3 PEDV ORF3基因遗传进化树构建34-38
• 4 讨论38-39
• 4.1 关于PEDV的流行情况38
• 4.2 PEDV ORF3基因的变异分析38-39
• 5 小结39-40
• 第二章 Eva Green荧光定量RT-PCR检测PEDV方法的建立40-61
• 1 材料40
• 1.1 菌株、质粒40
• 1.2 主要试剂40
• 1.3 主要仪器设备40
• 2 方法40-44
• 2.1 引物设计40-41
• 2.2 Eva Green荧光定量检测PEDV方法的建立41-44
• 2.2.1 PEDV ORF3基因的标准质粒制备41-42
• 2.2.2 EG-qRT-PCR反应条件的优化42
• 2.2.3 EG-qRT-PCR标准曲线和熔解曲线的建立42
• 2.2.4 EG-qRT-PCR特异性试验42
• 2.2.5 EG-qRT-PCR重复性试验42
• 2.2.6 EG-qRT-PCR灵敏度试验42-43
• 2.2.7 EG-qRT-PCR的临床应用43-44
• 3 结果44-57
• 3.1 PEDV ORF3基因标准质粒的构建44-45
• 3.2 EG-qRT-PCR退火温度及引物浓度优化结果45-46
• 3.3 EG-qRT-PCR标准曲线和熔解曲线的制作46-48
• 3.4 EG-qRT-PCR特异性试验结果48-49
• 3.5 EG-qRT-PCR重复性实验结果49-51
• 3.6 EG-qRT-PCR敏感性试验结果51-52
• 3.7 EG-qRT-PCR临床病料检测结果52-54
• 3.8 PEDV商品疫苗病毒含量的检测54
• 3.9 PEDV不同组织病毒含量检测54-57
• 4 讨论57-60
• 5 小结60-61
• 参考文献61-73
• 致谢73-74
• 附录74-77
• 攻读学位期间发表的学术论文目录77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘政龙;王金良;沈志强;;猪流行性腹泻病毒研究进展[J];中国畜牧兽医;2015年09期

2 刘琪;冯晓声;周如月;贾爱卿;王贵平;;鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用[J];广东畜牧兽医科技;2015年02期

3 周兵强;吴志明;闫若潜;赵雪丽;赵明军;陈慧娟;李宁;;2012-2014年河南省猪流行性腹泻病毒M基因和ORF3基因的遗传变异分析[J];中国兽医科学;2014年12期

4 李小英;;猪流行性腹泻诊断技术的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2014年15期

5 孟凡伟;张雪;王俊;单晶晶;王鹏;周双海;王志军;;猪流行性腹泻病毒Real-timePCR检测方法的建立[J];中国农学通报;2014年05期

6 邓祖丽颖;陈陆;;猪流行性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用[J];中国畜牧兽医;2014年01期

7 郭容利;何孔旺;茅爱华;刘浩飞;俞正玉;倪艳秀;温立斌;李彬;王小敏;张雪寒;吕立新;周俊明;;2011—2012年我国部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传变异分析[J];畜牧与兽医;2013年05期

8 郑逢梅;霍金耀;赵军;常洪涛;王晓梦;陈陆;王川庆;;2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J];病毒学报;2013年02期

9 刘随新;石达;陈建飞;张鑫;时洪艳;刘孝珍;张莎;王璐;冯力;;猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响[J];中国预防兽医学报;2013年03期

10 王靓靓;李训良;李鹏冲;任晓峰;;猪流行性腹泻的诊断与预防[J];世界华人消化杂志;2013年01期

本文编号：738815