一种文蛤多肽基因的克

发布时间：2017-08-26 09:17

  本文关键词：一种文蛤多肽基因的克隆、原核表达、纯化及功能性研究

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【摘要】：本研究结合分子生物学、微生物学及发酵工程技术与理论,构建文蛤原肌球蛋白原核表达工程菌及使用亲和层析的方法得到了目的蛋白。方法:根据基因工程技术结合原肌球蛋白相关基因信息,由其基因的特点设计出两段PCR引物,扩增基因得到目的基因,测序分析克隆结果。使用T载体快速扩增克隆目的基因,连接目的基因与表达载体。然后通过大肠杆菌诱导表达得到目的产物,使用亲和层析技术纯化目的蛋白。结果:文蛤原肌球蛋白多肽(MMTM)是一种抗癌多肽,分子大小约为32 kDa。从蛋白特性分析结果中,蛋白理论上p I值为4.5。基因测序结果与基因文库中文蛤原肌球蛋白序列有十几个碱基差异,而翻译为蛋白后目的蛋白的结果和目的基因一致,这种差异的原因可能是原核表达载体大肠杆菌的密码子偏好性和真核生物不同。最终由IPTG诱导发酵表达目的蛋白,凝胶分析可以看到在32 kDa左右有一深色条带,使用蛋白测序分析这种蛋白即为目的产物。发酵过程中发现目的产物的产量没有达到预计要求,为了后续的药理学实验研究所以设计了优化培养以提高目的蛋白的产量。方法:单因素实验确定几个因素最适条件,并筛选培养基的主要因素,选用五种培养基LB、LB+M9、M9、SOB、2*TY的摇瓶发酵,再根据结果设计培养基优化实验。首先使用PB设计确定发酵的主要因素及水平,然后由PB实验筛选因素中的最大影响因素设计交互实验结果得到各个因素最佳组合水平。结果:验证了适合发酵培养的因素有:有机碳源如葡萄糖、酵母粉及胰蛋白胨等,氮源如氯化铵、酵母粉及胰蛋白胨,无机盐成分等。这些因素都会影响发酵的进行,但环境因素如pH及溶氧量等因素也是制约的因素,而由于条件的限制实验未能进行。从五种培养基的筛选得出LB+M9混合培养基是大肠杆菌培养的合适选择,摇瓶发酵中菌体量达到50 g/L,说明充足的营养可以提高生物利用。PB设计结果说明葡萄糖、酵母粉及硫酸镁是影响目的蛋白产量的主要因素,然后利用中心点实验设计验证这三种因素的相互作用及结果,结果显示整模型统计学有效,设计符合发酵实验要求,其中葡萄糖和酵母粉对实验结果具有交互影响,通过实验优化验证目的产物得率提高了56%。通过体外抑制实验验证了目的产物对癌细胞抑制作用。利用MTT方法评价目的蛋白的细胞活性,DAPI染色方法说明了目的蛋白对癌细胞核形态及变化的作用,从而评价药物的作用。方法:研究通过体外细胞培养技术及MTT细胞抑制率实验评价了MMTM蛋白的癌细胞抑制活性。使用DAPI染色观察到MMTM细胞形态有显著变化。结果:细胞抑制实验表明MMTM对细胞有很好的抑制作用,在高浓度情况下可以很好的诱导细胞的凋亡,细胞形态表现为细胞固缩破碎,细胞质释放细胞死亡。DAPI染色结果表明加MMTM后细胞染色质颜色较亮,细胞核明显固缩,表现出不同程度的核碎片。由低到高目的蛋白浓度对细胞呈现为一定的浓度梯度,对肺及胰腺癌都呈现一定的浓度梯度活性,说明蛋白具有很好的的抗癌活性。
【关键词】：多肽 原核表达 发酵优化 细胞毒活性
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q51
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 文献综述10-22
• 1.关于文蛤研究10-12
• 1.1 文蛤的活性成分10-11
• 1.2 文蛤的药理作用11-12
• 2 抗癌药物研究12-21
• 2.1 中草药抗癌研究14-18
• 2.2 化学药物抗癌研究18-20
• 2.3 纳米材料的抗癌研究20-21
• 小节21-22
• 第二章 原核表达体系构建及鉴定22-48
• 1.试剂与材料22-25
• 1.1 材料22-23
• 1.2 实验试剂23-24
• 1.3 实验仪器24-25
• 2 试剂配制25-26
• 2.1 水平电泳试剂配制25
• 2.2 SDS-page电泳试剂配制25-26
• 2.3 透析液缓冲液配制26
• 3．实验方法26-38
• 3.1 文蛤总RNA提取26-27
• 3.2 DNA合成27-31
• 3.3 原核表达构建31-35
• 3.4 蛋白表达纯化35-37
• 3.5 目的蛋白含量测定37-38
• 4 实验结果38-45
• 4.1 文蛤总RNA质量38
• 4.2 PCR反应结果38-39
• 4.3 目的基因的序列测定及分析39-42
• 4.4 蛋白表达纯化结果42-45
• 5 讨论45-46
• 小节46-48
• 第三章 响应面法优化培养基48-67
• 1. 材料与仪器48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 实验试剂48-49
• 1.3 实验仪器49-50
• 2 试剂配制50-52
• 2.1 单因素培养基设定50
• 2.2 发酵培养基50-52
• 2.3 免疫荧光检测试剂52
• 3 试验方法52-56
• 3.1 单因素实验53
• 3.2 五种培养基的发酵53
• 3.3 PB实验设计53-54
• 3.4 响应面设计54-55
• 3.5 目的蛋白含量测定55-56
• 4. 实验结果56-65
• 4.1 单因素实验结果56-58
• 4.2 五种不同发酵培养基58-59
• 4.3 PB实验结果与分析59-60
• 4.4 响应面实验结果60-64
• 4.5 免疫印迹实验结果64-65
• 5 讨论65-66
• 小节66-67
• 第四章 蛋白的功能性研究67-77
• 1．试剂与材料67-68
• 1.1 实验材料67
• 1.2 实验设备67-68
• 2.试剂配制68-69
• 3.试验方法69-72
• 3.1 细胞复苏69
• 3.2 细胞传代69-70
• 3.3 细胞保存70
• 3.4 细胞质抑制率实验70-71
• 3.5 DAPI染色71-72
• 4.实验结果72-75
• 4.1 抑制率测定72-73
• 4.2 DAPI染色结果73-75
• 5．讨论75-76
• 小节76-77
• 结论77-78
• 参考文献78-84
• 致谢84-85
• 攻读学位期间发表的论文85-86

【参考文献】

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本文编号：740827