MicroRNA-99a通过BMPR2基因靶向调节大鼠间充质干细胞的早期软骨细胞分化

发布时间：2017-08-27 12:04

  本文关键词：MicroRNA-99a通过BMPR2基因靶向调节大鼠间充质干细胞的早期软骨细胞分化

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【摘要】：目的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是关节软骨再生的重要来源,因为MSCs具有软骨细胞分化的潜能,并且易于获取且可在体外扩增。目前,可调节软骨形成的特定micro RNAs(mi RNAs)尚未明确,其相关机制也未清晰,本研究旨在找出这些特定microRNAs并研究其机制。方法应用Real-time PCR、Western blot、免疫荧光显微技术和阿新蓝染色分析早期软骨细胞分化中mi RNAs、BMPR2、蛋白多糖、ACAN和COL2A1的表达水平。应用双荧光素酶报告基因分析验证miRNAs和BMPR2的靶向关系。结果mi RNAs通过与目标mRNA结合来降低蛋白质的合成,从而调节生物学过程。本研究中我们发现,在挪威棕色大鼠(Rattus Novegicus)间充质干细胞(rMSCs)早期软骨细胞分化过程中,mi R-99a和miR-125b-3p的表达明显升高。而抑制miR-99a,能够促进软骨细胞早期分化过程中蛋白多糖的沉积,并增加ACAN和COL2A1的表达。因此,调低miR-99a的表达能够促进rMSCs的早期软骨细胞分化。双荧光素酶报告基因检测表明,miR-99a作用于骨形态发生蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein receptor type 2,BMPR2)的3'-UTR上的一个假定的结合位点,miR-99a的过表达能够降低BMPR2蛋白的表达水平。在r MSCs早期软骨细胞分化的过程中,总p38和p-p38的表达在分化的第7天和第14天时增加;而在r MSC早期软骨细胞分化的过程中,总p38和p-p38蛋白下降的水平取决于miR-99a过表达的水平。在rMSC早期软骨细胞分化过程中,BMPR2的沉默能够逆转mi R-99a对蛋白多糖沉积、ACAN、COL2A1以及总p38蛋白、p-p38蛋白表达的抑制作用。结论这个大鼠间充质干细胞体外实验的研究结果,为miR-99a在早期软骨细胞分化中所扮演的角色提供了实验证明,miR-99a通过直接作用于BMPR2基因在软骨细胞分化的早期起到负调节因子的作用。
【关键词】：间充质干细胞 软骨细胞分化 microRNA-99a BMPR2 骨形态发生蛋白Ⅱ型受体
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料与方法12-16
• 2.1 大鼠间充质干细胞（rMSC）的分离与培养12
• 2.2 软骨细胞分化和细胞样品制备12-13
• 2.3 提取RNA进行实时定量PCR分析（qRT13
• 2.4 包装慢病毒并进行细胞转染13-14
• 2.5 Western blot14
• 2.6 免疫荧光显微技术检测14
• 2.7 将软骨细胞分化后的细胞进行阿新蓝染色14-15
• 2.8 构建载体进行双荧光素酶报告基因检测15
• 2.9 统计分析15-16
• 第3章 结果16-26
• 3.1 大鼠间充质干细胞（r MSC）早期软骨细胞分化过程中的6个miRNA的表达谱16-17
• 3.2 抑制MiR17-19
• 3.3 抑制MiR-99a使早期软骨细胞分化过程中的ACAN和COL2A1表达增加19-20
• 3.4 确定BMPR2是否是mi R20-22
• 3.5 BMPR2的沉默逆转了mi R-99a inhibitor对rMSC中蛋白多糖沉积的促进作用22-23
• 3.6 BMPR2的沉默逆转了miR-99a inhibitor对早期软骨细胞分化过程中ACAN和COL2A1表达的促进作用23-26
• 第4章 讨论26-28
• 参考文献28-32
• Table 1 Primers for quantitative real-time RT-PCR32-33
• Table 2 Primers for luciferase reporter construction33-34
• 读研期间的科研成果34-36
• 致谢36-37

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本文编号：745464