桂花CHS、DFR基因全长克

发布时间：2017-08-28 19:06

  本文关键词：桂花CHS、DFR基因全长克隆、表达分析及表达载体构建

  更多相关文章： 桂花 查尔酮合成酶 二氢黄酮醇还原酶 克隆 表达分析

【摘要】：桂花(Osmanthus fragrans Lour.)又名木犀,是我国十大名花之一,在园林应用上占有重要地位。根据其花色差异将桂花分为四个品种群,但种群间花色变异相对较小,主要为黄色和橙红色,缺乏蓝色等新奇花色,这在一定程度上限制了其观赏价值。花色素苷是植物体内最为重要的水溶性色素,其最重要的功能是赋予植物缤纷的色彩。目前其合成途径与调控机制都得到了充分的了解。CHS、DFR基因作为该途径当中两个关键基因已在多种植物中进行了克隆研究,但在桂花当中,其基因结构以及对桂花花色的形成所起到的调控作用尚未有报道,值得进行更为深入的探究。本实验以桂花橙红丹桂品种为试材,采用RT-PCR和RACE方法克隆丹桂查耳酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因以及二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydvroflavonol-4-reductase,DFR)基因cDNA全长。利用NCBI和DNAMAN分析软件对该基因进行核苷酸序列以及氨基酸序列的分析,利用DNAMAN软件直接构建系统进化树,分析该基因在不同物种间的进化关系。以橙红丹桂与籽银桂品种不同花期的样品为试材,采用荧光定量PCR和2-ΔΔCT法定量分析两个基因在不同花期的表达量。研究结果如下:(1)从橙红丹桂花瓣中成功获得了一个丹桂查耳酮合成酶基因cDNA全长,该基因全长为1383 bp,包含48 bp的5′非编码区、162 bp的3′非编码区和一个长度为1173bp编码390个氨基酸的开放阅读框。序列分析表明该基因具有Cysl64、His303和Asn3363个活性位点及2个决定底物特异性的苯丙氨酸残基Phe215、Phe265。该基因也具有查尔酮合成酶家族的两条特征多肽序列:RFMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。Blast序列分析显示该基因与同属木犀科的油橄榄相似性达92%,与其他双子叶植物的相似性在72%-76%左右。构建系统进化树分析表明,该基因聚类具有明显的种属特性,桂花与唇形科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达76%以上,符合植物分类学分类,为今后探究该基因在花色形成中的作用机制奠定了基础。后续进行荧光定量PCR结果显示,OfCHS基因在桂花的花瓣及叶片中均有表达,且在叶片中的相对表达量为初花期花瓣表达量的38倍,在橙红丹桂中随着花期,表达量呈现明显的先增后减的趋势,而在银桂品种中,在初花期表达量最高,而后逐渐降低。(2)从桂花(Osmanthus fragrans)花瓣中成功克隆了一个二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydvroflavonol-4-reductase,DFR)基因OfDFR全长(基因序列号:KR604812)。序列分析表明,该基因全长为1214bp,包含一个长度为1131bp编码376个氨基酸的开放阅读框,预测该基因编码的蛋白质分子量为99.68KD,等电点为4.98。功能域结构分析表明,该基因具有典型的DFR蛋白结构功能域,属于NADBRossmann超基因家族。进行同源性分析构建系统进化树分析表明,该基因在物种间的相似性较高;其中,桂花OfDFR基因与同属木犀科的连翘FiDFR基因亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,OfDFR在桂花叶片与花瓣中均有表达,且花瓣中的表达水平显著低于叶片;在不同开花时期的花瓣中,Of DFR基因的表达呈现出先升后降的趋势;该结果为进一步探究DFR基因在桂花花色形成中的功能与作用奠定理论基础。(3)将得到的两个基因全长分别与PBI121表达载体质粒构建基因表达载体,分别命名为35S”:OfCHS、35S”:OfDFR,并利用冻融法转化农杆菌GV3101感受态。
【关键词】：桂花 查尔酮合成酶 二氢黄酮醇还原酶 克隆 表达分析
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S685.13;Q943.2
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 花色苷的研究13-18
• 1.1.1 花色苷的化学结构和种类13-14
• 1.1.2 花色苷的研究历程和进展14-16
• 1.1.3 花色苷合成相关基因16-18
• 1.2 本研究的目的意义18-19
• 2 试验材料与方法19-35
• 2.1 试验材料19-22
• 2.1.1 植物材料19-20
• 2.1.2 菌株和质粒20
• 2.1.3 试验药品及试剂20
• 2.1.4 主要试剂配制及RNA提取物品的处理20-21
• 2.1.5 主要仪器及设备21-22
• 2.2 试验方法22-35
• 2.2.1 桂花花瓣及叶片总RNA的提取22-23
• 2.2.1.1 采用改良的CTAB法提取总RNA22-23
• 2.2.1.2 Trizol法提取桂花总RNA23
• 2.2.2 总RNA质量检测23-24
• 2.2.2.1 琼脂糖凝胶电泳法23-24
• 2.2.2.2 紫外吸收法24
• 2.2.3 反转录cDNA第一链的合成24-25
• 2.2.4 中间片段的扩增25-27
• 2.2.4.1 引物的设计25
• 2.2.4.2 PCR扩增25
• 2.2.4.3 目的条带切胶回收25-26
• 2.2.4.4 目的基因的连接与转化26
• 2.2.4.5 目的基因的转化26-27
• 2.2.4.6 阳性克隆的鉴定27
• 2.2.4.7 中间片段的测序27
• 2.2.5 5′序列的获得27-30
• 2.2.6 3′序列的获得30
• 2.2.7 全长拼接30
• 2.2.8 OfCHS与OfDFR基因理化性质的分析30-31
• 2.2.9 基因表达量的测定31-32
• 2.2.10 表达载体的构建32-34
• 2.2.11 冻溶法转化农杆菌34
• 2.2.12 拟南芥的转化、筛选与鉴定34-35
• 3 实验结果与分析35-55
• 3.1 总RNA的提取35
• 3.2 OfCHS和OfDFR基因全长的克隆及序列分析35-52
• 3.2.1 OfCHS基因全长的克隆35-37
• 3.2.1.1 OfCHS基因中间片段的克隆35-36
• 3.2.1.2 OfCHS基因全长的获得36-37
• 3.2.2 OfCHS基因序列分析37-44
• 3.2.2.1 OfCHS全长序列分析：37-39
• 3.2.2.2 OfCHS基因理化性质的分析39-44
• 3.2.3 OfDFR基因全长的克隆44-47
• 3.2.3.1 5′序列的获得44
• 3.2.3.2 3′序列的获得44-45
• 3.2.3.3 全长拼接45-47
• 3.2.4 桂花OfDFR蛋白的生物信息学分析47-52
• 3.3 基因的组织表达特性分析52-54
• 3.3.1 OfCHS、OfDFR在桂花不同器官及花期中的表达52-53
• 3.3.2 OfCHS、OfDFR在在桂花不同品种花瓣的表达53-54
• 3.4 植物表达载体的构建与鉴定54-55
• 4 讨论55-57
• 4.1 查尔酮合成酶基因的功能55-56
• 4.2 查尔酮合成酶基因与桂花花色相关性的探究56
• 4.3 二氢黄酮醇还原酶基因的功能56
• 4.4 二氢黄酮醇还原酶基因与桂花花色相关性的探究56-57
• 5 结论57-60
• 参考文献60-65
• 致谢65-66
• 攻读硕士期间发表的学术论文66

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 覃仁娟;百合DFR基因克隆及功能初步鉴定[D];四川农业大学;2014年

2 徐秀荣;桂花CHS、DFR基因全长克隆、表达分析及表达载体构建[D];山东农业大学;2016年

，

本文编号：749002