关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响

发布时间：2017-08-29 05:30

  本文关键词：关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响

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【摘要】：【目的】生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族。该家族包括MyoD1,Myf5,Myo G和Myf6,只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中;在其他的非肌细胞中,MyoD基因家族会被抑制。该家族中,MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等的调节,以维持个体骨骼肌的相对稳定,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素,具有尤为重要的作用,已成为研究热点。目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多,表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理;在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达,但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确。文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响,为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础。【方法】通过设计特异性引物克隆关岭牛MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2;同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1(+)和p GL3-Basic基本骨架,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-Myo G和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体p GL3-P1、p GL3-P2。重组质粒经酶切和测序鉴定后,利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞,30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性。最后根据荧光素酶的相对活性来分析MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响。【结果】克隆得到的关岭牛MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确,载体pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-Myo G、p GL3-P1和p GL3-P2经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;与相应剂量的对照组相比,转染pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD后,p GL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强,其中,在转染量为200 ng时增强作用最强,差异显著(P0.05);转染pcDNA3.1(+)-Myo G后,虽然对p GL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用,但差异不显著(P0.05);而转染pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-Myo G后,p GL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显(P0.05)。【结论】在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P0.05);而外源过表达转录因子MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性。说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。
【作者单位】： 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室/贵州大学动物科学学院;贵州大学生命科学学院;
【关键词】： 关岭牛 转录因子 启动子 MyoD基因家族 报告基因 荧光素酶活性
【基金】：国家转基因生物新品种培育重大专项(2013ZX08009-004) 黔科合重大专项(字[2013]6008号) 贵州省科技厅农业攻关项目(黔科合NY字[2012]3008号)
【分类号】：S823
【正文快照】： Influence of Myo D1 Promoter Activity by Myo DFamily of Guangling CattleZHANG Wen1,XU Hou-qiang1,CHEN Wei1,2,CHEN Xiang1,ZHAO Jia-fu1,HUAN Cong-cong1,2,XIA Dan1,ZHOU Di10引言【研究意义】转录因子是一类细胞核蛋白,它通过结合顺式作用元件(cis-acting element)

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本文编号：751582