陕北黄芥黄籽基因的精细定位及候选基因表达载体的构建

发布时间：2017-08-29 06:44

  本文关键词：陕北黄芥黄籽基因的精细定位及候选基因表达载体的构建

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【摘要】：油菜是世界上最主要的油料作物之一,是重要的食用油、饲料蛋白和工业能源作物。提高油菜种子含油量和品质育种一直是育种家研究的重要课题。大量研究表明,在相同的遗传背景下,黄籽油菜的含油量一般高于褐籽、黑籽,且黄籽油菜具有种皮薄、油清澈透明、蛋白质含量高等优点。然而目前广泛栽培的甘蓝型油菜中却没有天然的黄籽种质,育种家通过对芥菜型、白菜型油菜中黄籽材料遗传特性以及黄籽形成机理等的研究,希望通过远缘杂交、黄籽基因导入等培育出能够稳定遗传黄籽性状的甘蓝型黄籽油菜。陕北黄芥黄籽性状多表现为纯黄且遗传稳定,遗传模式较为简单,是研究黄籽基因的理想材料。本研究选用陕北吴旗地方品种——吴旗黄芥为主要研究材料,在前期研究的基础上,对吴旗黄芥和关中褐芥构建的BC6S1群体进行表型鉴定和遗传分析、黄籽基因精细定位、候选基因分析以及对候选基因构建超表达载体、沉默载体四方面的研究,以期进一步明确陕北黄芥黄籽性状形成的分子机制,为克隆黄籽基因进行转基因育种提供理论支撑。研究结果如下:1.表型鉴定和遗传分析:以吴旗黄芥为轮回亲本,关中褐芥为供体亲本构建1216个单株的BC6S1分离群体为分析群体,通过对BC6S1衍生的BC6S2、BC6S3连续两代单株种皮色观察,分析鉴定BC6S1群体种皮色基因型分配,结果在1216个BC6S1群体中,有纯合黄籽293株,纯合褐籽307株,杂合褐籽616株。卡方测验说明,黄/褐籽基因型分配符合1:2:1(χ2=0.22,p≤0.05)。此结果进一步证明陕北黄芥的黄籽性状受1对等位基因控制,褐籽对黄籽为显性。2.黄籽基因的精细定位:前人研究已将陕北黄芥的黄籽基因定位于A09染色体,本研究在其基础上,扩大群体为1216个单株,设计多态性引物63对,成功开发10个标记,其中IP标记5个、SCAR标记5个。构建了遗传连锁图谱,其中距离基因最近的两个标记IP4和Y1,位于基因的两侧,遗传距离分别是0.1和0.3cM;IP1、IP2、IP3标记与黄籽基因共分离,将距离黄籽基因较近的分子标记序列和白菜A基因组进行比对分析发现黄籽基因在A09连锁群27.079~27.616M范围内(约0.54Mb)。3.黄籽候选基因分析:对上述0.54Mb区域的95个基因进行结构分析和功能预测,结果表明仅有Bra036828基因与类黄酮合成途径相关,Bra036828基因和拟南芥F3H基因高度同源,因此初步确定Bra036828基因(芥菜型中命名为BjF3H-b1)为候选基因。克隆关中褐芥BjF3H-b1基因的CDS序列,序列全长1077bp,编码358个氨基酸。4.构建超表达载体和沉默载体:对已经克隆的BjF3H-b1基因,进行两次扩增得到目的基因片段,利用快速连接酶对表达载体pCAMBIA1301和扩增产物进行连接,并将连接产物转入大肠杆菌DH5α,筛选到含有目的基因的重组质粒,成功构建了候选基因Bj F3H-b1的超表达载体BjF3H-b1-1301和RNAi沉默表达载体silence2-1301,PCR和酶切检测验证重组子,并将验证后的质粒转入农杆菌感受态GV3101菌液中,完成表达载体的构建。
【关键词】：芥菜型油菜 黄籽 分子标记 精细定位 候选基因 载体构建
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-23
• 1.1 黄籽油菜的研究进展11-17
• 1.1.1 种皮颜色与油菜其他性状的相关性11-12
• 1.1.2 油菜种皮颜色的遗传研究12
• 1.1.3 油菜黄籽基因的定位12-14
• 1.1.4 油菜黄籽形成的机理研究14-17
• 1.2 图位克隆技术在油菜黄籽中应用17-20
• 1.2.1 分子标记技术在基因定位中的应用17-18
• 1.2.2 油菜黄籽基因的精细定位研究18-20
• 1.3 候选基因功能分析方法20-22
• 1.3.1 RNA干涉原理与应用20-21
• 1.3.2 超表达技术的应用21
• 1.3.3 遗传转化技术的应用21-22
• 1.4 本研究的目的和意义22-23
• 第二章 陕北黄芥黄籽基因的精细定位23-31
• 2.1 材料和方法23-25
• 2.1.1 试验材料23-24
• 2.1.2 试验方法24-25
• 2.2 结果与分析25-29
• 2.2.1 BC_6S_1群体种皮色基因型鉴定25
• 2.2.2 标记的开发与遗传图谱的构建25-28
• 2.2.3 序列分析及候选基因的确定28-29
• 2.3 讨论29-31
• 2.3.1 候选基因确定策略29
• 2.3.2 拟南芥标记的开发29-30
• 2.3.3 IP 标记的开发30-31
• 第三章 黄籽候选基因的表达载体构建及遗传转化研究31-43
• 3.1 试验材料31
• 3.2 试验方法31-34
• 3.3 结果与分析34-41
• 3.3.1 RNA、cDNA质量34-35
• 3.3.2 Bj F3H-b1 基因克隆结果与分析35-37
• 3.3.3 BjF3H-b1基因植物表达载体构建结果37-38
• 3.3.4 silence2-1301植物表达载体构建结果38-41
• 3.4 讨论41-43
• 3.4.1 BjF3H-b1-1301载体的构建41-42
• 3.4.2 silence2-1301载体的构建42
• 3.4.3 F3H基因研究进展42-43
• 第四章 全文总结43-44
• 4.1 全文结论43
• 4.2 试验下一步计划43-44
• 参考文献44-50
• 附录50-58
• 致谢58-59
• 作者简介59

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本文编号：751884