蛇床子三螺旋转录因子基因的克

发布时间：2017-08-30 05:34

  本文关键词：蛇床子三螺旋转录因子基因的克隆、表达、纯化及生物信息学分析

  更多相关文章： 蛇床子 三螺旋转录因子 基因克隆 蛋白质表达 生物信息学

【摘要】：1目的对中药蛇床子(Cnidium monnieri(L.)Cuss.)三螺旋转录因子(Trihelix Transcription Factor,ttf)基因进行克隆,并且诱导其在大肠杆菌BL21中表达,表达得到的目的蛋白进一步通过镍柱进行纯化,并利用生物信息学方法分析和预测该蛋白的可能的结构和各项生物学性质。2方法采用总RNA提取试剂盒提取蛇床子植物的总RNA,再逆转录得到cDNA,以后者为模板进行PCR扩增目的基因,将纯化得到的目的基因连接到pMD19-T克隆载体中,PCR及酶切鉴定后将得到阳性结果的目的基因与T载体的重组质粒送样测序。核酸测序鉴定正确后再将目的基因克隆到pET-22b(+)表达载体上,将所得的重组质粒再次作酶切和测序鉴定。将获得的正确的重组质粒ttf-pET-22b(+)转化到大肠杆菌E.coli BL21细胞中,以不同浓度的诱导剂诱导其表达,进一步利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹方法检测目的蛋白的表达情况,筛选得到最佳的表达条件,并进一步在大肠杆菌中大量表达,破碎菌体,收集上清中表达的蛋白,利用镍亲和柱进行纯化;通过Protparam、InterProScan、ExPASy、Coils、SmartBlast等各种生物学软件进行目的蛋白氨基酸序列比对、各种活性位点和结构域分析、结构预测、进化分析。3结果本研究首次成功地将蛇床子三螺旋转录因子基因克隆到了原核表达载体,利用IPTG进行诱导,目的基因得到了成功表达。Western-blotting结果表明,0.1mmol/l IPTG诱导表达蛋白效果最好,37℃条件下表达量较多。利用Protparam软件我们得知TTF蛋白含有179个氨基酸残基、理论分子质量为21254.7u,等电点为7.85;为可溶性蛋白,但在溶液中不稳定。利用Motif Scan我们分析了该蛋白质的各种基元,包括各种活性位点和结构域;PSORT预测了该蛋白质主要定位于细胞核和线粒体中;Predict Protein预测该蛋白质中规则的二级结构主要是卷曲螺旋,Coils软件预测E116-R142、R144-A163两段区域形成卷曲螺旋的可能性极大,根据NCBI的比对结果进行进化分析表明TTF基因与芝麻的亲缘关系最近。4结论1,在国际上首次体外成功克隆了蛇床子三螺旋转录因子ttf基因,并筛选得到了克隆该基因最佳PCR条件。2,成功构建了ttf基因的克隆重组质粒ttf-pMD19-T和表达重组质粒ttfpET22b(+)。3,将表达重组质粒ttf-pET22b(+)转化进BL21大肠杆菌感受态细胞中,在IPTG诱导下得到了很好的表达,在37度环境下,0.1mmol/L的IPTG诱导表达的蛋白量最多。4,对TTF蛋白进行了系统的生物信息学分析,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。
【关键词】：蛇床子 三螺旋转录因子 基因克隆 蛋白质表达 生物信息学
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239;Q943.2
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 英文缩略词表10-11
• 前言11-13
• 第一章 蛇床子三螺旋转录因子ttf基因的克隆13-32
• 1 实验材料13-14
• 1.1 实验菌种和植物13
• 1.2 实验仪器13-14
• 1.3 实验试剂14
• 2 实验方法14-24
• 2.1 蛇床子总RNA的提取14-16
• 2.2 逆转录合成cDNA16
• 2.3 PCR扩增目的基因ttf16-19
• 2.4 胶回收目的基因19
• 2.5 目的基因与克隆载体pMD-19的连接19-20
• 2.6 感受态细胞的制备实验20-21
• 2.7 感受态细胞的转化实验21-22
• 2.8 抽提重组质粒实验22-23
• 2.9 重组子双酶切实验23-24
• 3 实验结果24-31
• 4 实验结论31-32
• 第二章 蛇床子三螺旋转录因子ttf基因的表达与纯化32-45
• 1 实验材料32-33
• 1.1 实验仪器32-33
• 1.2 实验试剂33
• 2 实验方法33-38
• 2.1 表达载体的构建实验33-34
• 2.2 目的基因的诱导表达34-37
• 2.3 目的蛋白的纯化37-38
• 3 实验结果38-42
• 3.1 表达载体pET-22b与目的基因的连接38-39
• 3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE39-42
• 4 免疫印迹法western-blot42-43
• 5 实验结论43-45
• 第三章蛇床子三螺旋转录因子ttf基因的生物信息学分析45-54
• 3.1 目的基因核苷酸序列分析45-46
• 3.2 三螺旋转录因子蛋白理化性质分析46-48
• 3.3 目的蛋白TTF的基序、结构域和定位的分析48-50
• 3.4 三螺旋转录因子TTF同源性序列比对和进化分析50-52
• 3.5 目的蛋白的二级结构预测和溶剂的溶解性分析52-53
• 3.6 本章小结53-54
• 综述54-58
• 参考文献58-64
• 个人简介64
• 攻读学位期间发表论文情况64-65
• 致谢65

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本文编号：757542