应用表达谱芯片和荧光素酶报告系统筛选并鉴定大肠癌FOXQ1基因的潜在下游靶基因

发布时间：2017-08-30 09:43

  本文关键词：应用表达谱芯片和荧光素酶报告系统筛选并鉴定大肠癌FOXQ1基因的潜在下游靶基因

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【摘要】：第一部分利用基因芯片探究FOXQ1在结肠癌中的作用目的：探究人结肠癌细胞DLD1在敲低FOXQ1基因前后m RNA和microRNA的表达改变。方法：提取DLD1-shFOXQ1 和 DLD1-shControl两组细胞的RNA,分别与Whole Human Genome Oligo Microarray (4×44 K, Agilent Technologies)全基因组表达谱芯片和miRCURYTM LNA Array (v.18.0, Agilent Technologies) MicroRNA芯片进行杂交,应用GeneSpring、Genepix软件对芯片结果进行统计,对全基因组表达谱芯片进行GO、Pathway分析,对全基因组表达谱芯片和microRNA芯片结果进行关联分析,并应用qRT-PCR对部分结果进行验证。应用Microsoft Excel 和 SPSS17.0软件进行统计学分析。结果：全基因组表达谱的检测结果表明,敲低FOXQ1基因后,在芯片所涵盖的41093个基因中,以|FC|≥2作为具有显著性差异标准,共有255个基因上调,176个基因下调。QRT-PCR的验证结果与全基因组表达谱芯片的结果基本相符。MicroRNA芯片的检测结果表明,经敲低FOXQ1基因后,以|FC|≥2作为具有显著性差异标准,共有31个microRNA上调,12个microRNA下调。表明FOXQ1在结肠癌的发生和发展过程中,与细胞因子-细胞因子受体等途径存在密切关系。同时发现在结肠癌细胞系DLD1中,microRNA-208b-3p、microRNA-320d可能作为FOXQ1的上游,负向调控了FOXQ1的表达。结论：本研究了解了FOXQ1基因敲低前后mRNA和MicroRNA的表达改变,为后续FOXQ1在结肠癌的发生发展中的作用机制研究提供了重要的线索和实验依据。第二部分利用双荧光素酶报告系统探究FOXQ1在结肠癌中直接转录激活的靶基因目的：检测人结肠癌细胞DLD1中,FOXQ1直接转录激活的靶基因。方法：利用信息生物学JASPAR等工具进行FOXQ1靶位点的预测,构建含HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β5个基因启动子区域的萤火虫荧光质粒PGL3-enchancer,与 PRL-TK共转染shFOXQ1-DLD1 和 shcontrol-DLD1细胞,检测荧光强度改变以确定FOXQ1是否直接转录激活这五个基因。结果：分别成功构建了含HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β 5个基因启动子区域的萤火虫荧光质粒,证明在大肠癌细胞DLD1 中 FOXQ1并未直接靶向激活HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β基因的转录。结论：FOXQ1未直接转录激活HBEGF、PDGFβ、PDGFRβ、PLAT、IL1β 5个基因。
【关键词】：基因芯片 叉头框蛋白Q1 癌基因 双荧光素酶报告系统
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 绪论13-21
• 1.1 结肠癌的流行病学知识13-14
• 1.2 FOX转录因子基因家族14-15
• 1.3 FOXQ1基因研究现状15-16
• 1.4 上皮间质转化和FOXQ116-18
• 1.5 大肠癌中的FOXQ1基因研究18-19
• 1.6 本实验总体设计思路19
• 1.7 实验流程19-21
• 第二章 实验材料和仪器21-23
• 材料21-22
• 仪器22-23
• 第三章 实验内容23-100
• 第一部分 利用基因芯片探究FOXQ1在结肠癌中的作用23-72
• 1.1 实验过程23-35
• 1.1.1 RNA的获取23
• 1.1.2 QRT-PCR进行验证FOXQ1敲低效率23-25
• 1.1.3 Western blot验证FOXQ1蛋白表达量差异25-30
• 1.1.4 芯片样本准备与芯片杂交30-32
• 1.1.5 芯片扫描与结果分析32
• 1.1.6 芯片结果的验证32-35
• 1.2 结果35-69
• 1.2.1 FOXQ1敲低效率验证35
• 1.2.2 RNA质量验证35-36
• 1.2.3 mRNA芯片测定的基因表达量差异原始数据36-39
• 1.2.4 mRNA芯片GO分析39-51
• 1.2.5 mRNA芯片Pathway分析51-54
• 1.2.6 伴随FOXQ1敲低,microRNA的表达改变54-55
• 1.2.7 MicroRNA芯片的GO分析55-66
• 1.2.8 MicroRNA下调,mRNA上调结果关联分析66-67
• 1.2.9 MicroRNA上调,mRNA下调结果交联分析67-68
• 1.2.10 芯片结果qRT-PCR验证结果68-69
• 1.3 讨论69-72
• 1.3.1 片技术讨论69-70
• 1.3.2 FOXQ1相关基因的聚类分析和功能探究70-71
• 1.3.3 FOXQ1相关microRNA功能分析71-72
• 第二部分 利用双荧光素酶报告系统探究FOXQ1在结肠癌中直接转录激活的靶基因72-100
• 2.1 实验过程72-82
• 2.1.1 启动子结合位点预测72
• 2.1.2 萤火虫荧光素酶质粒的构建72-80
• 2.1.3 细胞转染和荧光检测80-82
• 2.2 实验结果82-93
• 2.2.1 获取启动子区域序列信息82
• 2.2.2 利用JASPAR预测结果82-84
• 2.2.3 五个基因PCR扩增结果84-86
• 2.2.4 五个基因测序的结果86-92
• 2.2.5 荧光素酶报告系统检测荧光强度92-93
• 2.3 讨论93-100
• 2.3.1 转录机制研究的重要意义93
• 2.3.2 JASPAR数据库93-94
• 2.3.3 双荧光素酶报告系统94-98
• 2.3.4 五个基因的选取依据98-99
• 2.3.5 实验失败原因分析99-100
• 第四章 结论100-101
• 参考文献101-106
• 附录106-108
• 附录A：攻读学位其间发表论文目录106
• 附录B：攻读学位其间参与科研项目106-107
• 附录C：部分词汇缩写中英文对照表107-108
• 附件108-119
• 致谢119

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本文编号：758567