利用数字基因表达谱测序分析鸡HSP25基因对细胞凋亡的作用

发布时间：2017-08-31 14:50

  本文关键词：利用数字基因表达谱测序分析鸡HSP25基因对细胞凋亡的作用

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【摘要】：在哺乳动物小分子热应激蛋白(Small heat shock proteins,s HSPs)家族中,热应激蛋白25/27kD(HSP25/27)基因的高表达能够主导聚集体沉积,防止错误折叠蛋白之间不可逆结合,从而缓解因内质网受协迫而造成的细胞凋亡。但卵生动物胚胎各组织中HSP25的序列和结构都异于哺乳动物。在热应激条件下,鸡HSP25基因(cHSP25)高表达是否也起着保护细胞的作用仍不明确。cHSP25在热应激诱导的细胞凋亡过程中涉及的信号通路未有报导,探究这些通路中的物质变化对阐明卵生动物特有的HSP25基因在细胞凋亡过程中的作用具有重要研究意义。本研究在37℃培养箱对鸡成纤维细胞系(DF-1)分别进行干扰和过表达cHSP25基因,通过数字基因表达谱(DGE)分析参与细胞凋亡的相关通路及相应基因的表达情况,利用热应激(45℃,3h)处理DF-1,qRT-PCR检测相关基因和流氏细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果表明:(1)干扰组cHSP25基因mRNA相对表达量下降50%;过表达组cHSP25基因mRNA相对表达量升高500倍。(2)DGE测序分析结果揭示,与对照组相比,干扰组只有1个未注释的下调差异表达基因;过表达组共有95个差异表达基因,其中60个为表达量上调基因,35个为下调基因。与干扰组相比,过表达组共有32个差异表达基因,其中有19个为表达量上调基因,13个为下调基因。鸡DF-1过表达cHSP25后,KEGG通路分析发现,PPARG和LAMA2富集于癌症通路等;BDNF富集于嗜中性粒细胞信号通路和经典MAP激酶信号通路。(3)在热应激处理鸡DF-1后,过表达组的HSP27和HSP70基因的表达显著下降,差异表达基因BDNF、LAMA2和PPARG及其相关通路的下游基因AKT和NFk B的表达量显著下调,流氏细胞术检测发现,S期细胞数增加,总凋亡细胞数增加。综上所述,在热应激条件下,鸡DF-1细胞系cHSP25基因持续高表达促使细胞周期停滞和加剧细胞凋亡,其通过下调HSP27和HSP70基因表达,并且抑制BDNF、LAMA2和PPARG及其下游通路基因AKT和NFk B在中性粒细胞信号通路和MAPK信号通路等的作用实现。
【关键词】：数字基因表达谱 鸡成纤维细胞系 HSP25基因 过表达
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-11
• 1 前言11-13
• 2 材料与方法13-31
• 2.1 实验材料与实验设计13-14
• 2.2 主要仪器设备14-15
• 2.3 主要试剂及配制15-17
• 2.3.1 主要试剂15-16
• 2.3.2 主要试剂配制16-17
• 2.3.2.1 克隆和细胞冻存所需试剂配制16
• 2.3.2.2 SDS-PAGE胶电泳所需试剂的配制16-17
• 2.3.2.3 Western Blot所需试剂的配制17
• 2.4 实验方法17-30
• 2.4.0 细胞培养方法17-18
• 2.4.0.1 鸡胚成纤维细胞DF-1 的复苏17-18
• 2.4.0.2 鸡胚成纤维细胞DF-1 的传代培养18
• 2.4.0.3 鸡胚成纤维细胞DF-1 的冻存18
• 2.4.1 不同温度刺激DF-1 细胞18-19
• 2.4.2 DF-1 的总RNA抽提方法19
• 2.4.3 DF-1 总RNA反转录19
• 2.4.4 荧光定量PCR引物设计19-21
• 2.4.5 qRT-PCR检测方法的组分和程序21
• 2.4.6 Western Bolt检测方法21-22
• 2.4.6.1 细胞蛋白样品制备21
• 2.4.6.2 总蛋白的保存21
• 2.4.6.3 Western Blot检测cHSP25蛋白的表达21-22
• 2.4.7 细胞凋亡检测22-23
• 2.4.8 细胞周期检测23-24
• 2.4.9 siRNA干扰鸡DF-1 中的HSP25基因24-25
• 2.4.9.1 HSP25干扰片段合成24
• 2.4.9.2 siRNA-cHSP25转染DF-124-25
• 2.4.9.3 cHSP25 siRNA干扰效果检测25
• 2.4.9.4 热应激下干扰cHSP25对相关基因及细胞的检测25
• 2.4.10 在鸡DF-1 中过表达cHSP2525-30
• 2.4.10.1 cHSP25基因分子克隆25-27
• 2.4.10.2 cHSP25过表达载体构建27-29
• 2.4.10.3 pcDNA3.1-cHSP25过表达载体转染DF-129
• 2.4.10.4 pcDNA3.1-cHSP25过表达载体转染效果检测29
• 2.4.10.5 热应激下过表达cHSP25对相关基因及细胞的检测29-30
• 2.5 数据分析30-31
• 3 结果31-68
• 3.1 干扰cHSP25基因对鸡DF-1 细胞系的影响31-35
• 3.1.1 cHSP25干扰片段转染效果31-33
• 3.1.1.1 转染干扰片段的DF-1 细胞形态31
• 3.1.1.2 细胞总RNA抽提和反转录31-32
• 3.1.1.3 cHSP25的干扰效果32-33
• 3.1.2 干扰cHSP25对其它HSPs的影响33-34
• 3.1.3 干扰cHSP25对细胞凋亡和细胞周期的影响34-35
• 3.2 过表达cHSP25基因对鸡DF-1 细胞系的影响35-40
• 3.2.1 pcDNA3.1-cHSP25过表达载体验证35-36
• 3.2.2 pcDNA3.1-cHSP25过表达载体转染效果36-38
• 3.2.2.1 转染过表达载体的DF-1 细胞形态36
• 3.2.2.2 细胞系总RNA抽提和反转录36-37
• 3.2.2.3 cHSP25过表达效果37-38
• 3.2.3 过表达cHSP25对其它HSPs的影响38
• 3.2.4 过表达cHSP25对细胞凋亡和周期的影响38-40
• 3.3 数字基因表达谱测序40-52
• 3.3.1 数据过滤统计40-42
• 3.3.2 比对分析42-43
• 3.3.3 表达量分析43-44
• 3.3.4 蛋白互作网络44-46
• 3.3.5 GO功能分析46
• 3.3.6 KEGG通路分析46-50
• 3.3.7 差异表达基因和下游通路基因检测50-52
• 3.3.7.1 干扰HSP25基因对差异表达基因及下游通路基因的检测50-51
• 3.3.7.2 过表达HSP25基因对差异表达基因及下游通路基因的检测51-52
• 3.4 热应激对DF-1 细胞系及期相关基因的影响52-58
• 3.4.1 不同温度条件下的细胞形态52-53
• 3.4.2 不同温度条件下的细胞总RNA抽提和反转录53
• 3.4.3 热应激对cHSP25表达量的影响53-55
• 3.4.4 热应激对其它HSPs的表达量影响55
• 3.4.5 热应激对差异表达基因和下游通路基因表达量的影响55-56
• 3.4.6 热应激对细胞凋亡和周期的影响56-58
• 3.5 热应激条件下干扰cHSP25基因对相关基因和细胞的影响58-63
• 3.5.1 热应激条件下cHSP25干扰片段转染效果58-59
• 3.5.1.1 热应激条件下转染干扰片段的DF-1 细胞形态58
• 3.5.1.2 细胞总RNA抽提和反转录58-59
• 3.5.1.3 热应激条件下cHSP25的干扰效果59
• 3.5.2 热应激条件下干扰cHSP25对其它HSPs的影响59-60
• 3.5.3 热应激条件下干扰cHSP25对差异表达基因和下游通路基因的影响60-61
• 3.5.4 热应激条件下干扰cHSP25对细胞凋亡和周期的影响61-63
• 3.6 热应激条件下过表达cHSP25基因对相关基因和细胞的影响63-68
• 3.6.1 热应激条件下pcDNA3.1-cHSP25过表达载体转染效果63-64
• 3.6.1.1 热应激条件下转染过表达载体的DF-1 细胞形态63
• 3.6.1.2 细胞系总RNA抽提和反转录63-64
• 3.6.1.3 热应激条件下cHSP25过表达效果64
• 3.6.2 热应激条件下过表达cHSP25对其它HSPs的影响64-65
• 3.6.3 热应激条件下过表达cHSP25对差异表达基因和下游通路基因的影响65-66
• 3.6.4 热应激条件下过表达cHSP25对细胞凋亡和周期的影响66-68
• 4 讨论68-74
• 4.1 细胞凋亡与细胞周期变化的关系68-69
• 4.2 热应激诱导HSPs表达促进细胞凋亡69-70
• 4.3 DGE测序分析的差异表达基因70-73
• 4.4 下游通路相关基因的分析73-74
• 5 结论74-75
• 致谢75-76
• 参考文献76-82
• 附录82-88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：766231