松树PicW同源基因的克隆及抗冻功能分析

发布时间：2017-09-02 03:22

  本文关键词：松树PicW同源基因的克隆及抗冻功能分析

  更多相关文章： 美国花旗松 华北落叶松 抗冻蛋白 原核表达 热滞活性

【摘要】：作为非生物胁迫之一的低温因子,影响并危害植物的生长及其繁衍规模。探究植物抗冻分子机制,挖掘抗冻相关基因,对于植物抗逆遗传改良,促进植物更好的适应低温环境具有重要的意义。本研究基于课题组前期的研究,从两个松树树种美国花旗松和华北落叶松中克隆出青杆云杉抗冻基因PicW的同源基因PmCAP和LpCAP,氨基酸一致率分别为77%和71%。PmCAP基因编码区序列长为576 bp,预测其可编码191个氨基酸,等电点为5.39;LpCAP基因编码区序列长为687 bp,可编码228个氨基酸,等电点为5.44。PmCAP、LpCAP和PicW均含有脱水素类蛋白特有的K片段重复单位,蛋白成分中含有大量疏水氨基酸如Lys、Ala、Thr等。二级结构主要包括α-螺旋和无规则卷曲组分,蛋白空间结构稳定性好。将基因PmCAP、 LpCAP分别导入大肠杆菌,经IPTG诱导目的蛋白表达后,转基因菌株在-5。C培养生长的半致死率时间介于50-54h之间,而对照组菌株半致死率时间为32 h；转基因菌株在-20℃培养生长的半致死率时间介于38-41 h之间,而对照组菌株半致死率时间为25 h,并且LpCAP抗冻性好于PmCAP。进一步提取纯化抗冻蛋白,利用DSC法测定PmCAP和LpCAP抗冻蛋白的热滞值分别为0.27和0.72,显著高于参考组系牛血清白蛋白(BSA)的0.05。研究结果得出,克隆的两个松树基因均具有较好的抗冻性能,可以用作植物抗冻分子育种研究资源。
【关键词】：美国花旗松 华北落叶松 抗冻蛋白 原核表达 热滞活性
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S791.24
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-5
• 缩略词表5-9
• 1 引言9-21
• 1.1 植物抗冻蛋白的研究9-14
• 1.1.1 植物抗冻蛋白10-12
• 1.1.2 植物抗冻相关蛋白12-14
• 1.2 脱水素蛋白的研究进展14-16
• 1.2.1 脱水素蛋白的结构特征14-15
• 1.2.2 脱水素的功能及作用机制15-16
• 1.3 抗冻蛋白的研究技术16-18
• 1.3.1 热滞活性测定16-18
• 1.3.2 冰晶形态分析18
• 1.4 研究目的和意义18-19
• 1.5 技术路线19-21
• 2 美国花旗松和华北落叶松PicW同源基因的克隆和生物信息学分析21-37
• 2.1 材料与方法21-26
• 2.1.1 实验材料21
• 2.1.2 实验方法21-26
• 2.1.2.1 植物DNA提取21-22
• 2.1.2.2 植物RNA提取22-23
• 2.1.2.3 目的基因的克隆23-24
• 2.1.2.4 目的片段回收24
• 2.1.2.5 目的片段与克隆载体连接24-25
• 2.1.2.6 大肠杆菌Top10感受态细胞的制备与转化25
• 2.1.2.7 鉴定阳性克隆25-26
• 2.1.2.8 基因序列及蛋白结构的预测分析软件26
• 2.2 研究结果26-36
• 2.2.1 火炬松基因组数据库中PicW同源基因的鉴定26-27
• 2.2.2 美国花旗松和华北落叶松的PicW同源基因的表达模式分析27-28
• 2.2.3 美国花旗松和华北落叶松PicW同源基因全长的克隆28-30
• 2.2.4 PmCAP和LpCAP基因的生物信息学分析30-36
• 2.3 讨论36-37
• 3 PmCAP和LpCAP基因原核表达载体的构建及蛋白提取纯化37-45
• 3.1 材料与方法37-40
• 3.1.1 实验材料37-38
• 3.1.2 实验方法38-40
• 3.2 研究结果40-44
• 3.2.1 PmCAP和LpCAP基因原核表达载体的构建40-41
• 3.2.2 PmCAP和LpCAP基因的转化41-42
• 3.2.3 PmCAP和LpCAP蛋白的诱导表达42-43
• 3.2.4 PmCAP和LpCAP蛋白的纯化43-44
• 3.3 讨论44-45
• 4 PmCAP和LpCAP蛋白的功能分析45-53
• 4.1 材料与方法45-46
• 4.1.1 目的蛋白溶液配制45
• 4.1.2 PmCAP和LpCAP蛋白的热滞值测定45
• 4.1.3 低温下细胞存活率检测与分析45-46
• 4.2 实验结果46-51
• 4.2.1 PmCAP和LpCAP蛋白的热滞值测定46-48
• 4.2.2 PmCAP和LpCAP基因转化大肠杆菌的抗冻性分析48-51
• 4.3 讨论51-53
• 5 结论53-55
• 参考文献55-61
• 个人简介61-63
• 导师简介63-65
• 获得成果目录65-67
• 致谢67

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本文编号：776097