紫花苜蓿无序蛋白MsZFP基因的克隆及功能研究

发布时间：2017-09-05 00:31

  本文关键词：紫花苜蓿无序蛋白MsZFP基因的克隆及功能研究

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【摘要】：固有无序蛋白是一类存在多种动态互变结构,具有正常的生物学活性的蛋白质。在分子调控网络中,固有无序蛋白通过与多种分子结合,引入复杂的多样性互作,进而在植物适应逆境和胁迫应答方面起到重要作用。MsZFP是一种转录因子具有手指状结构域,通过生物信息学预测其为固有无序蛋白,在细胞分化、基因表达调控、胚胎发育、增强植物胁迫的耐受性等方面具有重要作用。本研究从紫花苜蓿(Medicago sativa L)中克隆得到MsZFP基因,对烟草进行遗传转化,为MsZFP基因功能及紫花苜蓿抗逆机理的研究奠定基础。主要研究结果如下:1.MsZFP基因的克隆与序列分析通过RT-PCR方法克隆了MsZFP基因,该基因含有762 bp的开放读码框,编码253个氨基酸。具有2个保守的单C2H2型结构域。对其开放读码框氨基酸进行无序性分析,发现其为固有无序蛋白。通过与其它物种中MsZFP近源基因的比对及进化树构建发现,紫花苜蓿MsZFP基因与蒺藜苜蓿、大豆、花生等物种中近源基因的亲缘关系较近。2.pCBM-MsZFP植物表达载体的构建构建了含有MsZFP基因的植物表达载体pCBM-35S-MsZFP,含有草丁膦筛选标记基因PPT和组成型启动子35S。3.MsZFP基因对烟草的遗传转化通过农杆菌介导法将MsZFP基因转入烟草,获得43株PPT抗性植株。对植株基因组DNA进行PCR鉴定,获得25株阳性植株。通过实时定量PCR对阳性植株基因表达量进行检测,结果表明,转基因株系OX3、OX15、OX23中MsZFP的表达量比较高。4.对转基因烟草的抗逆性分析将野生型(WT)和转基因烟草置于-4℃处理2 h,观察到WT叶片明显萎蔫,其相对电导率明显高于转基因烟草。在0℃低温胁迫处理下,转基因烟草的丙二醛含量明显低于WT,脯氨酸、可溶性蛋白含量明显高于WT。表明MsZFP基因可以提高植物的耐寒能力。将WT和转基因烟草相同部位叶圆片浸泡于300 mM Na Cl溶液,7天后转基因烟草仍保持绿色而WT明显失绿,转基因烟草的叶绿素含量明显高于WT,表明MsZFP基因可提高植物对盐胁迫的耐受性。
【关键词】：固有无序蛋白 紫花苜蓿 MsZFP基因 抗逆 植物
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 第1章 绪论10-15
• 1.1 固有无序蛋白的研究进展10-12
• 1.1.1 固有无序蛋白的分类及其特点10-11
• 1.1.2 固有无序蛋白的预测方法11
• 1.1.3 固有无序蛋白的功能11-12
• 1.2 ZFP蛋白的研究进展12-14
• 1.3 本研究的目的和意义14-15
• 第2章 紫花苜蓿MsZFP基因的克隆15-30
• 2.1 引言15
• 2.2 实验材料和仪器15-17
• 2.2.1 实验材料15
• 2.2.2 实验仪器及药品15-17
• 2.3 实验方法17-22
• 2.3.1 紫花苜蓿叶片RNA的提取17-18
• 2.3.2 cDNA的合成18-19
• 2.3.3 PCR扩增目的基因19
• 2.3.4 目的基因的回收19-20
• 2.3.5 大肠杆菌Top10感受态细胞制备20-21
• 2.3.6 目的基因克隆载体的构建21
• 2.3.7 目的基因的测序和生物信息学分析21-22
• 2.4 实验结果22-29
• 2.4.1 紫花苜蓿MsZFP基因的克隆22-23
• 2.4.2 pMD18T- MsZFP克隆载体的构建23-24
• 2.4.3 MsZFP序列的生物信息学分析24-29
• 2.5 本章小节29-30
• 第3章 MsZFP植物表达载体构建及对烟草的遗传转化30-44
• 3.1 引言30
• 3.2 实验材料和仪器30-32
• 3.2.1 实验材料30
• 3.2.2 实验仪器及药品30-32
• 3.3 实验方法32-37
• 3.3.1 农杆菌感受态EHA105的制备32-33
• 3.3.2 植物表达载体构建33-35
• 3.3.3 农杆菌介导的烟草的遗传转化35-36
• 3.3.4 转MsZFP基因烟草分子生物学检测36-37
• 3.4 实验结果37-43
• 3.4.1 植物表达载体构建37-41
• 3.4.2 农杆菌介导的烟草遗传转化及转基因烟草的PCR检测41-42
• 3.4.3 转基因烟草的qRT-PCR检测42-43
• 3.5 本章小结43-44
• 第4章 转基因烟草抗逆性分析44-52
• 4.1 引言44
• 4.2 实验材料和仪器44
• 4.2.1 实验材料44
• 4.2.2 实验仪器及药品44
• 4.3 实验方法44-47
• 4.3.1 生理指标检测44-46
• 4.3.2 烟草抗逆性分析46-47
• 4.4 实验结果47-50
• 4.4.1 转基因烟草低温抗性分析47-48
• 4.4.2 烟草低温抗性相关生理指标检测48-49
• 4.4.3 转基因烟草盐耐性分析49-50
• 4.5 本章小节50-52
• 第5章 讨论52-55
• 5.1 植物无序蛋白与逆境胁迫52
• 5.2 C2H2型锌指蛋白转录因子在抵抗胁迫方面的作用52-53
• 5.3 紫花苜蓿基因MsZFP具有抗逆功能53-54
• 5.4 下一步工作展望54-55
• 结论55-56
• 参考文献56-61
• 攻读硕士学位期间所发表的学术论文61-63
• 致谢63

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1 陈月;紫花苜蓿无序蛋白MsZFP基因的克隆及功能研究[D];哈尔滨师范大学;2016年

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本文编号：794758